Особенности окислительного стресса у гороха в условиях раздельного и комбинированного действия гипертермии и засоления

Окислительный стресс, который определяют как реакцию организма на присутствие в среде избытка оксидантов, в растениях возникает в результате действия практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху, почвенное засоление, низкие и высокие температуры, свет высокой интенсивности, ультрафиолетовое излучение, патогены различной природы и др. (Рогожин. 2002. Суворов, Чудинова. 2009). Можно предположить, что окислительный стресс входит как компонент в большинство других стрессов. Такая универсальность в индукции окислительного стресса при действии на растения самых разнообразных стрессоров указывает на принципиально важное значение антиоксидантных систем, снижающих внутриклеточные концентрации активных форм кислорода (АФК), а также систем, ликвидирующих токсические продукты взаимодействия АФК с биополимерами и повышающих устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды вообще (Чевари, 1985, Рогожин, 2004). По этой причине представляется интересным изучение разных стресс-воздействий на генерацию АФК и активность антиоксидантных систем (АОС) для последующего выявления качественных связей между этими функциональными элементами.

Целью данной работы было исследование раздельного и комбинированного влияния гипертермии и хлоридного засоления на генерацию АФК в побегах гороха, а также на динамику активности ряда антиоксидантных ферментов (АОФ) – супер-оксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Первый фермент катализирует реакцию дисмутации двух су-пероксиданионов, а второй участвует в разложении перекиси водорода.

Объекты и методы исследования

Исследования проводили на проростках гороха ( Pisum sativum L) сорта Альфа. Для проращивания использовали семена, стерилизованные 4%-ным раствором перманганата калия в течение 30 мин. Трехдневные проростки неделю выращивали методом водной культуры на питательной смеси Прянишникова (0.5 нормы). Далее проростки подвергали тепловому воздействию и засолению по следующей схеме: 1) закаливающая температура (37°С) – 3ч, 2) повреждающая температура (42^оС) – 3ч, 3) засоление 0,3% NаСI – 1ч, 4) закаливающая температура и последующее засоление в этот же день, 5) повреждающая температура и последующее засоление в этот же день. Контролем служили проростки, выращенные при комнатной температуре на питательной смеси без засоления. Окислительный стресс изучали через 1 ч и через неделю после воздействий. Определяли общее содержание перекиси водорода ферротиоционатным методом (Лукаткин, 2002, а). Генерацию супероксидного радикала (СОР) определяли методом, в основе которого лежит способность последнего окислять адреналин в адренохром (Лукаткин, 2002, б). Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс (Королюк, 1981). Для определения активности супероксиддисмутазы использовали метод, основанный на способности этого фермента конкурировать с нитросиним тетрозоли-ем за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата (Полесская, 2007). Повторность эксперимента – трехкратная.

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты (табл . 1) показали угнетающее действие стрессоров на проростки гороха на 6-е сутки эксперимента. Наиболее сильно рост проростков подавлялся при температуре 42°С и при засолении. Предварительная обработка умеренной температурой (37°С) снижала ростингиби-рующий эффект последующего засоления. Это наводит на мысль о закаливающей роли умеренного термического воздействия и формировании кроссадаптации. Предварительная обработка повреждающей температурой (42^оС), наоборот, усугубляла негативное влияние засоления.

Таблица 1

Ростовые параметры проростков гороха, см

Варианты воздействия	Время отбора проб
	1 час	6 суток
Контроль	14.9 + 0.9	15.0 + 1.3
37оС	14.9 + 0.5	14.4 + 0.8
42оС	15.1 + 0.9	10.4 + 1.1
NaCl	13.3+0.6	11.9 + 0.6
37оС+NaCl	12.8 + 0.7	13.7 + 1.0
42оС+NaCl	14.5 + 0.8	9.2 + 0.8

Содержание СОР через 1 ч после воздействия повышенных температур увеличивалось (табл. 2). Засоление без температурной обработки и при предварительном прогреве до 37оС не вызывало заметного изменения СОР. При действии сильных стрессоров (гипертермии 42оС и последующего засоления), приводящих к серьезным нарушениям метаболизма, интенсивность генерации СОР увеличивалась.

Результаты, представленные в таблице 3, показывают заметный рост количества перекиси водорода в вариантах с сильным воздействием стрессоров (42оС и 42оС +NaCl). В остальных случаях ее содержание было относительно стабильным.

Таблица 2

Содержание супероксидного анион радикала в проростках гороха, усл. ед.

Варианты воздействия	Время отбора проб
	1 час	6 суток
Контроль	0.26 + 0.04	0.23 + 0.04
37оС	0.40 + 0.06	0.17 + 0.02
42оС	0.36 + 0.06	0.48 + 0.08
NaCl	0.27 + 0.02	0.18 + 0.05
37оС+NaCl	0.26 + 0.05	0.17 + 0.02
42оС+NaCl	0.52 + 0.08	0.44 + 0.07

В целом показатели исследуемых АФК находились в обратном соотношении с интенсивностью роста проростков. В связи с этим можно предположить, что уровень СОР и перекиси водорода может служить индикатором стресса у растений.

Таблица 3

Содержание перекиси водорода в проростках гороха, мМоль

Варианты	Время отбора проб
	1 час	6 суток
Контроль	0.007 + 0.0004	0.008 + 0.0009
37оС	0.010 + 0.0012	0.009 + 0.0014
42оС	0.006 + 0.0090	0.015 + 0.0025
NaCl	0.006 + 0.0006	0.009 + 0.0013
37оС+NaCl	0.006 + 0.0005	0.006 + 0.0009
42оС+NaCl	0.006 + 0.0007	0.017 + 0.0025

Через 1 ч после температурного воздействия наблюдалось заметное снижение активности СОД, тогда как через неделю активность этого фермента была существенно выше, чем в контрольном варианте (табл. 4). Засоление вызывало рост активности СОД, особенно через 6 суток. Часовое воздействие высоких температур и последующее засоления приводило к подавлению СОД, однако через неделю активность этого фермента заметно возрастала. Возможно, эти изменения активности СОД связаны с действием неспецифических факторов защиты – белков теплового шока (БТШ), синтез которых носит транзитный характер. При синтезе БТШ происходит изменение синтеза других белков, которые образуются в норме. Обращает на себя внимание резкий рост активности СОД при засолении, а также при комплексном воздействии повреждающих температур и засоления. Возможно, в этом случае действие неспецифических защитных систем заканчивается. Дальнейший процесс адаптации связан уже с работой специализированной системы защиты, к которую входят и ферменты окислительного стресса. СОД - единственный фермент, участвующий в ликвидации токсического действия супероксидного радикала.

Таблица 4

Активность супероксиддисмутазы в проростках гороха, усл. ед.

Варианты воздействия	Время отбора пробыта
	1 час	6 суток
Контроль	8.6 + 0.3	7.60 + 0.8
37оС	7.8 + 0.4	13.9 + 2.1
42оС	3.0 + 0.2	12.9 + 1.5
NaCl	12.7 + 0.9	22.6 + 1.8
37оС+NaCl	5.7 + 1.1	17.3 + 2.6
42оС+NaCl	4.2 + 0.9	8.9 + 1.1

Активность каталазы сохранялась повышенной во всех опытных вариантах, особенно при засолении в сочетании с предварительным прогревом закаливающей температурой (табл. 5). Возможно, такая динамика нарастания активности каталазы связана с постепенным увеличением концентрации перекиси водорода вследствие реакции дисмута-ции, направленной на ликвидацию супероксидного аниона. Кроме того, каталаза имеет низкое сродство к субстрату и начинает «работать» только при достаточно высоком содержании перекиси.

Таблица 5 Активность каталазы в проростках гороха, усл. ед.

Варианты воздействия	Время отбора проб
	1 час	6 суток
Контроль	62.0 + 9.3	67.1 + 7.2
37оС	63.3 + 10.9	66.1 + 6.5
42оС	66.5 + 17.5	74.8 + 10.6
NaCl	62.2 + 11.7	80.4 + 4.9
37оС+NaCl	67.4 + 4.3	97.6 + 13.8
42оС+NaCl	79.3 + 8.6	60.0 + 6.7

В целом характер изменения активности каталазы в эксперименте в значительной степени совпадал с характером изменения активности СОД, что позволяет выдвинуть предположение о принадлежности этих ферментов к одному магистральному пути утилизации АФК.

Полученные результаты показали, что гипертермия и засоление как раздельно, так и в комплексе индуцируют окислительный стресс разной силы, который выражается в генерации АФК и в активации АОС. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры 42оС и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании окислительного стресса в этих условиях. Последнее может привести к необратимым повреждениям и даже гибели растений.

Предварительная обработка закаливающей температурой (37оС) повышала активность антиоксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации, которая обеспечивается функционированием неспецифи- ческих механизмов устойчивости. В целом полученные результаты указывают на существование хорошо скоординированной системы защиты от окислительного стресса в условиях действия умеренных стрессовых факторов.