Особенности первичной структуры гена Ph-3, выявленные при создании нового маркера устойчивости томата к фитофторозу

Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, - одно из самых вредоносных заболеваний томатов. Наиболее перспективным методом борьбы с ним остается выведение устойчивых сортов, при создании которых широко используется интрогрессия генов устойчивости из дикорастущих родственных видов. В частности, несколько генов устойчивости к фитофторозу, идентифицированных у дикого вида томата Solanum pimpinellifolium , были интрогрессированы в культурные сорта. Наиболее сильным геном считается Ph-3 , поскольку он обеспечивает устойчивость к множеству изолятов P. infestans . На сегодняшний день известны ДНК-маркеры, так или иначе ассоциированные с этим геном. Однако в геноме томата были обнаружены гомологи этого гена, которые не обладают функциональной активностью. В настоящей работе впервые показано, что в сортах томата отечественной селекции при наличии гена Ph-3 отсутствуют другие его гомологи. Также впервые установлено, что в последовательности гена Ph-3 присутствует вставка ретротранспозона, которая может приводить к потере геном своей функциональной активности. Нашей целью было создание простого в использовании высокоспецифичного ДНК-маркера гена Ph-3 , с помощью которого можно отличить Ph-3 от его структурных гомологов, и валидация этого маркера в сравнении с уже известными маркерами на основе анализа коллекции отечественных сортов и линий томата и оценки связи маркеров с полевой устойчивостью к фитофторозу. В работе использовали 24 образца томата ( Solanum lycopersicum L.). Исследования проводили в 2021 году на опытном поле ФГБНУ ФНЦО (Московская обл., Одинцовский р-н). Рассаду высаживали в грунт в I декаде июня. Поражение фитофторозом учитывали в динамике через каждые 7 сут, начиная с появления первых симптомов (III декада июля). Тотальную ДНК выделяли из молодых листьев 2-недельных растений при помощи набора реагентов Сорб-ГМО-Б («Синтол», Россия). Дизайн праймеров для специфичной амплификации гена Ph-3 осуществляли на основе множественного выравнивания нуклеотидной последовательности гена Ph-3 (GenBank no. KJ563933) и его структурных гомологов SlRGA1 , SlRGA2 , SlRGA 3 и SlRGA4 . Были подобраны праймеры, амплифицирующие фрагмент гена Ph-3 размером 412 п.н.: прямой 5'-AATATTGAAAATAGCTGCACTGA-3' и обратный 5'-CGAGATTTGGAGGGAATGTAA-3'. Созданный маркер получил название Ph3-412. Кроме того, для сравнительного анализа использовали праймеры маркера NC-LB-9-6678, амплифицирующие фрагменты размером 601 и 907 п.н.: 5'-CCTTAATGCAATAGGCAAAT-3' и 5'-ATTT-GAATGTTCTGGATTGG-3', последовательности которых абсолютно консервативны для гена Ph-3 и его гомологов. Для определения нуклеотидных последовательностей полученных ампликонов их клонировали в вектор pAL-TA («Евроген», Россия), которым трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5a, и секвенировали по методу Сэнгера. Осуществляли множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей с последующим анализом результатов выравнивания. Для построения дендрограммы использовали программу TREECON (http://bioinfor-matics.psb.ugent.be/software/details/Treecon). Производные аминокислотные последовательности были получены с помощью программы EditSeq (https://macdownload.informer.com/editseq/down-load/). Для поиска гомологов полученных последовательностей в базе данных NCBI использовали программу BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). При сравнении результатов молекулярного анализа с данными фенотипической оценки полевой устойчивости к фитофторозу ни один из маркеров не показал однозначной связи с полевой устойчивостью. Мы подтвердили, что амплифицируемый с помощью праймеров Ph3-412 фрагмент принадлежит гену Ph-3 , в то время как фрагмент размером 601 п.н., который получают с праймерами NC-LB-9-6678, соответствует гомологу SlRGA4. Показано, что фрагмент размером 907 п.н., полученный с теми же праймерами, гомологичен гену Ph-3 , но при этом содержит вставку LTR ретротранспозона семейства Ty1- copia размером 306 п.н. У всех сортов, у которых был обнаружен ген Ph-3 , он содержал вышеуказанную вставку. Наличие такой вставки может приводить к потере функциональной активности, что необходимо учитывать при маркировании гена Ph-3 . Исходя из этого, набольшую селекционную ценность представляют генотипы, у которых ген Ph-3 не имеет вставки ретротранспозона.