Особенности продукции интерлейкина-19 у пациентов с атеросклерозом

Saranchina J.V., Dutova S.V., Kilina O.Y., Khanarin N.V., Kulakova T.S. Features of interleukin-19 production in patients with atherosclerosis. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2021;36(2):52–60.

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), в частности, ишемическая болезнь сердца и ее осложнение – инфаркт миокарда, являются главной причиной смертности населения как в России, так и в зарубежных странах (по данным Росстата, 2019). Одной из ключевых причин развития ССЗ является атеросклероз (АС). АС коронарных сосудов опасен своими осложнениями, такими как окклюзия сосуда, разрыв атеросклеротической бляшки (АБ) с последующим тромбообразованием, что может привести к острому коронарному синдрому и внезапной сердечной смерти. Осложнения АС являются одними из наиболее частых причин инвалидности и смертности в большинстве стран мира.

АС представляет собой комплексное мультифактор-ное заболевание средних и крупных артерий, в котором задействованы множественные генетические и экологические факторы. В связи с высокой заболеваемостью и смертностью от ССЗ, особенно в трудоспособном возрасте, с каждым годом возрастает значимость раннего прогнозирования их риска развития.

К настоящему моменту выполнено большое количество исследований, раскрывающих этиологию и механизмы развития АС, выявлено много потенциальных маркеров, в том числе содержащихся в сыворотке крови, ассоциированных с развитием АС [1–3]. Установлено, что решающее значение для развития АБ имеет воспалительный процесс, клеточные и гуморальные компоненты которого принимают участие на разных этапах атероге-неза. Именно от взаимодействия про- и противовоспалительных реакций зависит исход патологического процесса при АС и его осложнениях [4]. Несмотря на доказанную значимость цитокиновой регуляции в данном патологическом процессе, роль отдельных цитокинов продолжает изучаться.

Одним из возможных кандидатов на роль ингибирования таргетирования воспаления является интерлейкин-19 [5–8]. Тем не менее функции и возможности использования этого цитокина не вполне исследованы и описаны, в связи с чем необходимо более подробно изучить его роль в патогенезе АС.

Цель исследования: изучение особенностей локальной и системной продукции интерлейкина-19 у пациентов с АС.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 46 пациентов (26 женщин и 20 мужчин), проходивших лечение по поводу артериальной гипертензии в терапевтическом отделении Республиканской клинической больницы им. Г.Я. Реми-шевской. Верификация атеросклеротического поражения сосудов проводилась с помощью ультразвукового исследования. Ультразвуковое исследование брахиоцефальных артерий выполнялось на ультразвуковом сканере Philips En Visor (Philips, Нидерланды) с многочастотным датчиком с рабочей частотой 5–10 МГц. АБ определялись как локальное утолщение стенки сосуда на 50% или больше по сравнению с окружающими участками стенки или как очаговое утолщение комплекса интима-медиа более 1,5 мм выступающего в просвет сосуда. Оценивалось наличие АБ и стенозов в 6 областях брахиоцефального бассейна: обе общие сонные артерии, обе бифуркации и обе внутренние сонные артерии. Процент стеноза был рассчитан локально в поперечном сечении в области максимального сужения просвета сосуда (Рекомендации Европейского общества сосудистых хирургов, 2017). Средний возраст обследуемых составил 63,4 ± 3,2 года. В контрольную группу вошли 40 человек (23 женщины и 17 мужчин, средний возраст 44,7 ± 5,5 лет), не имеющих атеросклеротического поражения стенок сосудов, острых и хронических заболеваний в фазе обострения, не принимающих противовоспалительные и антимикробные препараты.

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и получило положительное заключение этического комитета Хакасского государственного университета им. Н.Ф. Катанова (г. Абакан, 27.01.2017 г., протокол № 5). Все испытуемые дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

В качестве материала для исследования в группе пациентов с АС (основная группа) выступали образцы АБ и венозная кровь, в контрольной группе – только венозная кровь. АБ были получены путем эндартерэктомии, затем они подвергались гомогенизации с последующим ферментативным гидролизом в течение 1 ч при температуре 37 °С коллагеназой IV Gibco (Thermo Scientific) в присутствии инигибиторов протеиназ III Gibco (Thermo Scientific). Из полученного гомогената АБ центрифугированием выделяли мононуклеарные лейкоциты на градиенте плотности фиколл-урографин 1,077 г/см3, доводили до концентрации 2 млн клеток в 1 мл культуральной среды. Выделенные мононуклеары культивировали в полной среде RPMI-1640 в пенициллиновых флаконах в течение 24 ч при температуре 37 °С. Выделение мононуклеар-ных лейкоцитов из крови проводили по вышеописанному методу. Для оценки цитокин-продуцирующей способности лейкоцитов крови и лейкоцитов, выделенных из АБ, определяли спонтанную и митоген-индуцированную продукцию цитокинов. В качестве митогена для стимуляции Т-лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА) (Sigma-Aldrich) в рабочей концентрации 6 мкг/мл (добавляли 10 мкл на 1 мл культуральной среды).

Уровень ИЛ-19 определяли в сыворотке крови, гомогенате АБ и супернатантах спонтанной и ФГА-индуциро-ванной лейковзвеси методом иммуноферментного анализа с помощью наборов фирмы eBioscence (Австрия).

Статистический анализ данных включал описание количественных показателей медианами ( Ме ) и межквартильными интервалами ( Q1; Q3 ). Для сравнения групп использовали непараметрические критерии Манна – Уитни и Вилкоксона. Для оценки взаимосвязи между изучаемыми показателями проводили подсчет коэффициента корреляции Спирмена. Статистически значимыми считали различия и корреляции при р ≤ 0,05. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ STATISTICA 8.0.

Результаты

Сывороточный уровень ИЛ-19 у больных АС не имел статистически значимых различий по сравнению с группой контроля и составил 113,5 (88,91–120,29) пг/мл и 116,67 (108,22–142,02) пг/мл соответственно (табл. 1).

При оценке спонтанной продукции цитокина было установлено, что в группе больных с АС наблюдалось статистически значимое увеличение экспрессии ИЛ-19 по сравнению с контрольной группой в 2 раза [204,78 (108,22–257,88) пг/мл и 103,39 (84,09–110,64) пг/мл соответственно, р = 0,05].

Таблица 1. Уровень ИЛ-19 в сыворотке крови и индуцированная продукция интерлейкина лейкоцитами крови

Table 1. Blood serum levels of IL-19 and its induced production by blood leukocytes

Показатели Indicators		Контрольная группа Control group	Больные с АС Patients with atherosclerosis	р
Сывороточный уровень ИЛ-19, пг/мл Serum level of IL-19, pg/mL		116,67 (108,22–142,02)	113,05 (88,91–120,29)	0,46
Продукция ИЛ-19 лейкоцитами крови, пг/мл IL-19 production by blood leukocytes, pg/mL	Спонтанная продукция Spontaneous production	103,39 (84,09–110,64)	204,78 (108,22–257,88)	0,05
	ФГА-индуцированная продукция PHA-induced production	110,64 (102,19–127,53)	174,60 (114,26–756,33)	0,07
	Индекс стимуляции Stimulation Index	1,13 (1,02–1,17)	1,19 (0,79–2,57)	0,91

Примечание: жирным шрифтом и закрашенными ячейками выделены статистически значимые различия по показателям.

Note: the boldface and shaded cells indicate statistically significant differences between the indicators.

Полученные данные отражают активацию клеток-продуцентов in vivo . ФГА-индуцированная продукция данного цитокина также имела тенденцию к повышению у больных с АС, однако статистически значимых различий не выявлено. Результаты расчета индекса стимуляции в обеих обследуемых группах находились на одном уровне и не имели статистически значимых различий. Следовательно, резервные возможности лейкоцитов крови больных с АС к продукции ИЛ-19 сохраняются на высоком уровне, что, вероятно, может быть обусловлено началом или разгаром процессов, регулируемых этим цитокином.

При сравнении содержания ИЛ-19 в сыворотке крови и гомогенате АБ у пациентов с АС статистически значимых различий не установлено ( р = 0,182). Так, сывороточный уровень цитокина составил 113,05 (88,91– 120,29) пг/мл, в то время как в гомогенате АБ – 96,15 (88,91–108,22) пг/мл. Результаты корреляционного анализа показали отрицательную связь между уровнем ИЛ-19 в сыворотке и гомогенате АБ, однако она не имела статистической значимости ( R = –0,009; р = 0,97). Так как в данном случае происходит сравнение продукции цитокинов на местном и системном уровне, то очевидным является то, что при снижении уровня продукции цитокинов в АБ повышается продукция цитокинов лейкоцитами, находящимися в системном кровотоке, т. е. происходит вовлечение в патологический процесс всего организма, что свидетельствует о протективной роли данного цитокина.

Повышение продукции данного цитокина в сыворотке крови приводит к изменению соотношения Th1/Th2 в сторону Th2 в результате угнетения выработки INFγ и усиления продукции IL-4 и IL-13, усиливает синтез клетками внутриклеточных белковых факторов-регуляторов апоптоза (молекул bсl-2). Кроме того, IL-19 влияет на дифференцировку Th-клеток, вызывая секрецию IL-10, что приводит к подавлению воспалительного процесса [9–11].

Таким образом, ИЛ-19 способствует стабилизации бляшки, а значит, снижает риск ее разрыва и осложнений. Однако, как мы видим, этот механизм регуляции иммунного ответа является неэффективным. Вероятно, это обусловлено взаимодействием ИЛ-19 с другими регуляторными цитокинами, которые не дают проявиться его функции в полной мере. Также, возможно, неэффективность ИЛ-19 обусловлена наличием полиморфизма генов, приводящего к низкой продукции цитокина, или низкой эффективностью его связывания с рецепторами.

Спонтанная продукция ИЛ-19 лейкоцитами, выделенными из АБ, не имела статистически значимых различий по сравнению с уровнем данного цитокина, продуцируемого лейкоцитами крови, и составила 113,05 (87,10– 157,71) пг/мл и 204,78 (108,22–257,88) пг/мл соответственно (табл. 2).

Уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-19 лейкоцитами АБ был равен 111,84 (89,52–182,45) пг/мл, что было статистически значимо ниже, чем у лейкоцитов крови 174,60 (114,26–756,33) пг/мл ( р = 0,04).

Таблица 2. Результаты определения уровня продукции ИЛ-19 лейкоцитами крови и лейкоцитами, выделенными из атеросклеротической бляшки, у пациентов с атеросклерозом

Table 2. Results of determining the level of IL-19 production by blood leukocytes and white blood cells isolated from the atherosclerotic plaques in patients with atherosclerosis

Продукция ИЛ-19, пг/мл IL-19 production, pg/mL	Лейкоциты, выделенные из крови White blood cells isolated from the blood	Лейкоциты, выделенные из АБ White blood cells isolated from the atherosclerotic plaques	р
Спонтанная продукция Spontaneous production	204,78 (108,22–257,88)	113,05 (87,10–157,71)	0,13
ФГА-индуцированная продукция PHA-induced production	174,60 (114,26–756,33)	111,84 (89,52–182,45)	0,04
Индекс стимуляции Stimulation Index	1,19 (0,79–2,57)	1,00 (0,80–1,39)	0,34

Примечание: жирным шрифтом и закрашенными ячейками выделены статистически значимые различия по показателям.

Note: the boldface and shaded cells indicate statistically significant differences between the indicators.

Соответственно, индекс стимуляции лейкоцитов АБ был снижен по сравнению с лейкоцитами периферической крови, но статистически значимых различий выявлено не было. Таким образом, у лейкоцитов крови существуют резервные возможности к продукции ИЛ-19, а у лейкоцитов в составе АБ значительно снижены, что приводит к прогрессированию патологического процесса, т. е. в отношении синтеза ИЛ-19 у лейкоцитов формируется дефект на местном уровне.

Результаты корреляционного анализа между показателями продукции ИЛ-19 лейкоцитами крови и АБ показали, что при снижении местного уровня данного цитокина наблюдается его гиперпродукция в сыворотке, что может рассматриваться как благоприятный прогностический признак (табл. 3).

Таблица 3. Результаты корреляционного анализа продукции ИЛ-19 лейкоцитами крови и атеросклеротической бляшки

Table 3. The results of correlation analysis of IL-19 production by blood and atherosclerotic plaque leukocytes

Показатели Indicators		ИС продукции ИЛ-19 лейкоцитами крови Stimulation Index of IL-19 production by blood leukocytes	ФГА-индуцированная продукция ИЛ-19 лейкоцитами АБ PHA-induced IL-19 production by atherosclerotic plaque leukocytes
Сывороточный уровень ИЛ-19 Serum level of IL-19	R	– 0,57	–
	p	0,018	–
Спонтанная продукция ИЛ-19, синтезируемая лейкоцитами крови Spontaneous production of IL-19 by blood leukocytes	R	–0,03	0,63
	p	0,91	0,04

Примечание: R – коэффициент корреляции Спирмена, р – уровень статистической значимости, жирным шрифтом и закрашенными ячейками выделены статистически значимые различия по показателям.

Note: R – the Spearman correlation coefficient, p – the level of statistical significance. The boldface and shaded cells indicate statistically significant differences between the indicators.

Обсуждение

Существует мнение, что дефицит IL-19 может вызвать активацию пролиферации сосудистых гладкомышечных клеток (Vascular Smooth Muscle Cells, VSMC) и синтеза провоспалительных цитокинов (включая IL-1β и TNFα) [12, 13], что подтверждено исследованиями с использованием нокаутных по IL-19 мышей [14, 15]. Полученные данные позволили авторам предположить возможность использования IL-19 в качестве мощного супрессора развития АС.

В настоящее время появились новые факты в пользу этого предположения. Целью исследования группы ученых Медицинских университетов Филадельфии и Нью-Йорка в 2016 г. явилось определение возможности экзогенного IL-19 снижать прогрессирование атеросклеротического поражения сосудов и описание возможных молекулярных механизмов действия этого противовоспалительного цитокина. Мышам, нокаутным по рецептору липопротеинов низкой плотности (LDLR-/-), давали корм с повышенным содержанием холестерина в течение 12 нед., затем вводили рекомбинантный IL-19 (животным контрольной группы – фосфатно-буферный солевой раствор) в течение еще 8 нед. Авторы статьи считают, что

IL-19 остановил прогрессирование АС, так как только у мышей контрольной группы констатировали увеличение числа макрофагов на 54%. Кроме того, при анализе атеросклеротических поражений сосудов у мышей экспериментальной группы (получавших IL-19) выявили ключевые показатели регрессии АС: уменьшение общего числа макрофагов и увеличение содержания маркеров макрофагов фенотипа M2 (участвуют в иммунных реакциях Th2 типа, стимулируют процессы пролиферации и ангиогенеза). Дополнительные исследования показали, что IL-19 способствует активации основных путей, ведущих к поляризации иммунного ответа в сторону увеличения числа Th2 лимфоцитов и M2 макрофагов: сигнальных белков-активаторов транскрипции (Signal transducer and activator of transcription, STAT3, STAT6), транскрипционного Kruppel 4 подобного фактора (Kruppel-like factor 4) и ядерных рецепторов гамма, активируемых пероксисомными пролифераторами (Peroxisome proliferator-activated receptors gamma PPARγ). Поэтому IL-19 может уменьшать индуцированное цитокинами воспаление in vivo . Таким образом, авторы описали новую роль IL-19 в регулировании липидного метаболизма макрофагов с помощью γ-рецепторной регуляции поглощения холестерина, зависимой от пероксисомных пролифераторов, а также увеличения оттока холестерина, опосредованного АТФ-связы-вающим кассетным транспортером (ATP-binding cassette transporter – ABCA1). Эти факты свидетельствуют о том, что IL-19 может останавливать прогрессирование АС, регулируя как роль макрофагов в воспалении, так и метаболизм липидов макрофагов [14].

Результаты еще одного исследования показали важную роль IL-19 в пролиферации и трансформации VSMC. Именно трансформация VSMC в пенистые клетки приводит к увеличению размера АБ и снижению их стабильности, является ключевым, но недостаточно понимаемым этапом атерогенеза. Авторы статьи установили, что IL-19 индуцирует экспрессию мышечно-специфичной микроРНК (miR133a) в VSMC. По мнению авторов, miR133a может уменьшать экспрессию белкового адаптера рецептора липопротеинов низкой плотности 1 (Low-density lipoprotein receptor adapter protein 1 – LDLRAP1) – адаптерного белка, который необходим для интернализации рецептора липопротеинов низкой плотности (LDL). Таким образом, IL-19 уменьшает накопление липидов в VSMC и поглощение ими окисленных LDL в miR133a-зависимом механизме. Исследователи доказали, что LDLRAP1 экспрессируется в АБ и неоин-тимальном слое VSMC мышей и участках артерий человека, поврежденных атеросклеротическим процессом. Возможность стимуляции экспрессии miR133a в VSMC с помощью IL-19 доказывает неизвестную ранее связь между метаболизмом сосудистых липидов и воспалением и может рассматриваться в качестве новой терапевтической мишени для борьбы с сосудистыми воспалительными заболеваниями [15].

Еще один факт, свидетельствующий о важной роли IL-19 в процессе пролиферации VSMC, описан в работе A. Herman и соавт. [16]. Авторы приводят доказательства того, что противовоспалительный IL-19 снижает функцию мРНК-связывающего белка (mRNA-Stability Protein HuR) в VSMC человека, что, возможно, снижает их способность к пролиферации. При анализе многочисленных современных данных о роли цитокинов в иммунных процессах, связанных с АС, полученных с помощью животных модельных систем, D.P. Ramji и T.S. Davies (2015) отмечают, что IL-19 действительно способствует уменьшению проявлений АС [8].

В настоящее время экспериментально установлены следующие механизмы противоатерогенного действия IL-19: Th2-поляризация иммунного ответа, уменьшение адгезии лейкоцитов, подавление экспрессии генов про-воспалительных цитокинов, снижение неоинтимальной гиперплазии путем уменьшения активации VSMC [17].

Основным продуцентом ИЛ-19 в АБ являются моноциты. Активация Тh0 ведет к поляризации иммунного ответа по Th2- типу за счет продукции ИЛ-4 и ИЛ-10, что в свою очередь приводит к подавлению продукции провос-палительных цитокинов. Также активируются Treg-лимфоциты, супрессирующие иммунный ответ и способству- ющие уменьшению хронического воспаления. Активация транскрипционных факторов и ядерных рецепторов клеток (STAT3, STAT6, Kruppel-like factor 4, PPARγ) приводит к активации макрофагов М2-типа, что способствует повышению ангиогенных цитокинов и усилению ангиогенеза. Кроме того, ИЛ-19 оказывает влияние на гладкомышечные клетки за счет снижения функции мРНК связывающего белка, что ведет к снижению способности VSMC к пролиферации и индукции miR133a, который уменьшает экспрессию LDLRAP1, что снижает неоинтимальную гиперплазию, лежащую в основе формирования АБ [17, 18]. В результате ранее проведенного обзора литературы о функциональном значении ИЛ-19 в воспалительных процессах и атерогене-за, а также на основании полученных результатов была обобщена роль ИЛ-19 в патогенезе АС (рис. 1).

По результатам проведенного исследования можно предположить, как происходит регуляция функций ИЛ-19 в патогенезе АС. На ранних этапах формирования АБ макрофаги продуцируют провоспалительные цитокины, такие как ФНО-альфа, ИФН-гамма и другие, что приводит к развитию воспалительных реакций в стенке сосуда. В то же время повышение продукции провоспалитель-ных цитокинов запускает каскад активации противовоспалительных цитокинов, что приводит к увеличению экспрессии и интерлейкина-19 [19]. ИЛ-19 способствует угнетению воспаления в бляшке за счет активации Т-ре- гуляторных лимфоцитов, Th2-поляризации иммунного ответа и снижения неоинтимальной гиперплазии [20]. Однако при длительном воспалении наблюдается истощение резервов продукции ИЛ-19, что запускает порочный круг при воспалительном процессе в АБ. Но при этом наблюдается повышение продукции ИЛ-19 на системном уровне, что также способствует подавлению воспаления и стабилизации бляшки (рис. 2).

В этом заключается проатерогенный эффект ИЛ-19, который реализуется именно за счет генерализованной продукции.

Рис. 2. Регуляция воспалительного процесса в патогенезе развития атеросклероза ИЛ-19 Примечание: сплошные стрелки – активационный сигнал, стрелки пунктиром – ингибирующий сигнал.

Fig. 2. The IL-19-dependent regulation of inflammatory process in the pathogenesis of atherosclerosis Note: the solid arrows are the activation signal; the dotted arrows are the inhibitory signal.

Согласно нашим исследованиям, индуцированная продукция цитокина в АБ находится в положительной взаимосвязи со спонтанной продукцией лейкоцитов крови, т. е. продукции этого цитокина должно быть достаточно для остановки формирования воспаления в АБ, но по каким-то причинам этого не происходит. Вероятно, на одном из этапов патогенеза действие цитокина оказывается неэффективным. Возможными причинами данного явления могут быть следующие: во-первых, нарушение экспрессии рецепторов на клетках-мишенях; во-вторых, подавление активности экспрессии цитокина другими интерлейкинами, например, ИЛ-33, который обладает схожими эффектами с ИЛ-19 по запуску Th2-лимфоцитов. Кроме того, ИЛ-33 снижает активность моноцитов и их адгезии к стенке сосуда, а продуцентами ИЛ-19 как раз являются моноциты; в-третьих, возможно, происходит выработка антагонистов рецепторов ИЛ-19, которая ме- шает цитокинам связываться с рецепторами на клетках, это также может быть обусловлено полиморфизмом генов цитокиновых рецепторов.

Заключение

Таким образом, при снижении резервных возможностей лейкоцитов, входящих в состав АБ, происходит подавление активности ИЛ-19, что приводит к прогрессированию воспаления. Однако за счет компенсаторного повышения экспрессии цитокина на системном уровне механизмы привлечения моноцитов и пролиферации гладкомышечных клеток в стенке сосуда ингибируются, и формируется стабильная бляшка. Полученные результаты свидетельствуют в пользу противоатерогенной роли ИЛ-19 и того, что в АБ сохраняются механизмы отрицательной регуляции воспаления за счет продукции ИЛ-19.