Особенности распределения митохондриального цитохрома с у больных колоректальным раком

Введение. Колоректальный рак (КРР) является третьей по значимости причиной смерти от рака в мире после рака легких и предстательной железы у мужчин и рака легких и молочной железы у женщин [1–3]. В последние годы эпидемиологические исследования показали, что правосторонний рак толстой кишки (RCC), развивающийся в слепой, восходящей ободочной кишках или изгибе печени, характеризуется худшим прогнозом по сравнению с левосторонним (LCC), возникающим в изгибе селезенки, нисходящей, сигмовидной и ректосигмоидной кишках [4]. Пол пациента также может влиять на прогноз исхода колоректального рака, при этом выживаемость мужчин ниже [5]. Уровень циркулирующих эстрогенов, оральные контрацептивы, заместительная гормональная терапия, диета, физическая активность и разнообразие микробиома были предложены в качестве факторов, ответственных за снижение заболеваемости колоректальным раком и смертности от него среди женщин [6]. Однако у женщин чаще диагностируется более агрессивная правосторонняя проксимальная опухоль [7]. Причина этого различия неизвестна, но вполне вероятно существование разной биологии колоректального рака у двух полов.

Злокачественные опухоли характеризуются высокой скоростью пролиферации и сопутствующим повышенным энергетическим метаболизмом. Хотя повышенный гликолиз является общепризнанным вариантом выработки энергии при раке, считается, что важную роль играют и митохондрии, влияющие на энергетический баланс злокачественных клеток. Действительно, возникновение изменений митохондрий, вызванных раком, было установлено во многих исследованиях [8, 9]. Так, трансформации раковых клеток были связаны с мутациями митохондриальной ДНК, влияющими на активность дыхательных и ан-тиапоптотических белков, изменениями в мембранном потенциале митохондрий и образованием активных форм кислорода. Сообщалось также о других связанных с раком изменениях метаболических и сигнальных функций митохондрий [10, 11].

Понимание механизмов развития и прогрессирования КРР необходимо для улучшения его лечения. Как источник энергии эукариотической клетки митохондрии играют важную роль в гомеостазе кишечника. Митохондрии запускают врожденные и адаптивные иммунные реакции, стимулируя воспаление и пути самозащиты. Митохондрии имеют большое значение для сохранения надлежащей целостности эпителиального барьера во время воспаления и занимают центральное место в онкогенезе [12].

Цитохром C, имея двойное назначение в жизни и гибели клеток, является ключевым металлопротеином в митохондриальном метаболизме и гомеостазе [13]. В условиях гомеостаза цитохром С действует как переносчик электронов в дыхательной цепи митохондрий, представляя собой важный фактор «сборки» и функционирования дыхательных суперкомплексов [14]. Дополнительный уровень регуляции активности процесса окислительного фосфорилирования посредством посттрансляционного фосфорилирования цитохрома С может иметь существенное значение для контроля потребления кислорода и образования вредных активных форм во время гомеостаза и патологии [15].

Цель исследования. Изучение уровня цитохрома С в митохондриях, изолированных из клеток различных отделов толстой кишки мужчин и женщин.

Материалы и методы. Были изучены материалы, полученные от 132 больных раком толстой кишки T2-3N0M0 (52 женщины и 80 мужчин). Средний возраст составил 66 (58–73) лет, 68 (51,5 %) чел. находились в возрасте старше 65 лет, 64 (48,5) чел. – в воз- расте до 65 лет. Раком сигмовидной кишки страдали 46 (34,8 %) чел., в т.ч. 19 женщин, раком прямой кишки – 44 (33,7 %) чел., в т.ч. 18 женщин, а раком восходящего отдела ободочной кишки – 42 (31,5 %) чел., в т.ч. 15 женщин. Степень дифференцировки опухоли у всех больных соответствовала G2. Никто из участников исследования до операции не получал адъювантного лечения. Хороший статус показателей (ECOG 0 или 1) имелся у 98,5 % больных. Все больные были прооперированы.

Во время операции после лапаротомии выполняли мобилизацию пораженного опухолью участка толстой кишки с перевязкой и пересечением питающих кровеносных сосудов, далее производили лимфодиссекцию и выполняли резекцию пораженного органа (правостороннюю гемиколэктомию, левостороннюю гемиколэктомию, резекцию сигмовидной кишки, резекцию прямой кишки) с удалением злокачественной опухоли. Часть опухолевого материала и фрагмент ткани кишки по линии резекции сразу помещали в холодную стерильную среду выделения, содержащую 0,22 М манни-тола, 0,3 М сахарозы, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4. Операция завершалась наложением межкишечного анастомоза, дренированием брюшной полости и ушиванием лапаротомной раны.

Митохондрии из клеток тканей опухоли и кишки выделяли дифференциальным центрифугированием на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E (Becman Coulter, USA) по методу М.В. Егоровой и С.А. Афанасьева, А.П. Гуреев, А.В. Кокина [16, 17]. Для разрушения межклетoчных связей, клетoчной стенки и плазматических мембран применяли механическую обработку тканей с измельчением нoжницами и гомогенизацией в стекляннoм гoмoгенизаторе с те-флонoвым пестикoм (гомогенизатор Пoтте-ра – Эльвегейма). На каждый грамм ткани дoбавляли по 10 мл стерильнoй среды выделения. Ткани гoмoгенизировали и центрифу-гирoвали: первый раз в течение 10 мин при скорости 1000 g, температуре 0–2 °С, втoрой и третий – в течение 20 мин при 20000 g и той же температуре. Между процедурами цен- трифугирoвания провoдили ресуспендирoва-ние oсадка митохoндрий в среде выделения. Митохондрии допoлнительно очищали от лизoсом, перoксисом, меланoсом и т.п., центрифугируя в 23 % градиенте Перкoлла. Суспензию субклеточных структур наслаивали на градиент Перкoлла, центрифугировали 15 мин при 21000 g, после чего наблюдали разделение на 3 фазы, oставляли нижний слoй митохoндрий и ресуспендирoвали его средoй выделения. Следующую прoмывку митoхон-дрий осуществляли путем центрифугирoва-ния в течение 10 мин при 15000 g, температуре 0–2 °С. Полученные митохондриальные образцы до анализа хранили при -80 ºС. Перед проведением анализа образцы разводили до концентрации белка 6 г/л [16]. Концентрацию цитохрома С (нг/мг белка) определяли методом ИФА (Bioscience, Austria).

В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации. От всех пациентов получено подписанное информированное согласие на взятие и передачу биологического материала для проведения научных исследований, государственных заданий в общественно и социально полезных целях.

Статистический анализ результатов проводили с приенением пакета программ Statisti-ca 10.0. Распределение нормальности оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка (для малых выборок). Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) осуществляли с использованием критериев Стьюдента и Манна – Уитни. Значение p<0,05 было сохранено в качестве предела статистической значимости. Данные таблиц представлены в виде M±m, где M – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка среднего.

Результаты и обсуждение. Результаты изучения содержания цитохрома С в митохондриях, изолированных из тканей различных отделов толстой кишки, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Table 1

Содержание цитохрома С в митохондриях клеток ткани толстой кишки мужчин и женщин, нг/мг белка

Mitochondrial cytochrome C content in colon tissue cells in men and women, ng/mg protein

Образцы Samples	Мужчины Men	Женщины Women
Ткань прямой кишки Rectal tissue
Интактные митохондрии Intact mitochondria	4,1±0,13	2,4±0,1 p2=0,0000
Митохондрии опухоли Tumor mitochondria	7,2±0,37 p1=0,0000	7,0±0,55 p1=0,0000
Ткань сигмовидной кишки Sigmoid colon tissue
Интактные митохондрии Intact mitochondria	5,0±0,16	3,6±0,13 p2=0,0000
Митохондрии опухоли Tumor mitochondria	7,7±0,31 p1=0,0000	5,1±0,36 p1=0,0003 p2=0,0000

Ткань восходящего отдела ободочной кишки Ascending colon tissue
Интактные митохондрии Intact mitochondria	5,1±0,27	2,9±0,35 p2=0,0000
Митохондрии опухоли Tumor mitochondria	10,4±0,52 p1=0,0000	5,8±0,46 p1=0,0000 p2=0,0000

Примечание. Статистически значимые различия по отношению к: р¹ – показателю соответствующей ткани по линии резекции; р² – показателю у мужчин.

Note. р¹ – the differences are statistically significant compared with the parameter of the corresponding tissue along the resection line; p² – the differences are statistically significant compared with the parameter in men .

При изучении содержания цитохрома С в ткани опухоли различных отделов толстой кишки мужчин установлено, что в митохондриях опухолей прямой, сигмовидной кишок и восходящего отдела ободочной кишки уровень цитохрома С был выше, чем в митохондриях клеток соответствующих тканей, в 1,8, 1,5 и 2,0 раза соответственно. У женщин в митохондриях опухолей тех же отделов толстой кишки уровень цитохрома С был выше, чем в митохондриях соответствующих тканей, в 2,9, 1,4 и 2,0 раза соответственно. При сравнении уровней цитохрома С у мужчин и женщин было установлено, что в митохондриях опухоли прямой кишки концентрации цитохрома С не имели статистически значимых отличий, в митохондриях опухолей сигмовидной кишки и восходящего отдела ободочной кишки содержание цитохрома С у мужчин было в 1,5 и 1,8 раза выше, чем у женщин, соответственно.

Таким образом, установлено, что в митохондриях опухоли различных отделов толстой кишки содержание цитохрома С было выше, чем в соответствующей интактной ткани, вне зависимости от пола больных. Практически во всех изученных тканях (кроме опухоли прямой кишки) митохондрии мужчин содержали больше цитохрома С, чем митохондрии женщин.

Митохондрии действуют как источник энергии для здоровых клеток, поскольку они потребляют питательные вещества, такие как глюкоза, и вырабатывают большую часть энергии клетки за счет окислительного фосфорилирования [18]. Однако в опухолевых клетках митохондрии вырабатывают меньше энергии, а питательные вещества реорганизуются в «строительные блоки» для поддержания роста опухолевых клеток. Метаболические различия между нормальными и злокачественными клетками изучаются для выявления новых потенциальных целевых терапевтических подходов. В клетках КРР, по сравнению со клетками здоровых тканей толстой кишки, количество митохондрий увеличено, что приводит к росту максимальной частоты дыхания [19]. Однако метаболическое перепрограммирование все еще происходит на ранней стадии аденомы и приводит к индукции эффекта Варбурга [20]. Усиленное митохондриальное дыхание способствует пролиферации клеток рака толстой кишки и способствует онкогенезу и прогрессированию опухоли [21, 22]. Клетки рака толстой кишки используют митохондриальное дыхание как основной источник энергии для поддержки своей пролиферации и инвазии, тем самым способствуя злокачественности и прогрессированию заболевания [23].

Таким образом, зафиксированное нами повышение уровня цитохрома С косвенно подтверждает данные литературы об увеличении частоты дыхания в опухолевых клетках. Найдены и гендерные отличия между уровнями цитохрома С в митохондриях клеток ткани различных отделов толстой кишки, особенно выраженные в опухолях. Так, у мужчин особенно «активными» были митохондрии клеток ткани опухоли восходящего отдела толстой кишки, а у женщин – митохондрии клеток ткани опухоли прямой кишки.

Когда-то предполагалось, что биологическая функция цитохрома С ограничена митохондриями и его способностью соединять комплексы III и IV в цепи переноса электронов. Функциональность этого белка действительно контролируется in vivo несколькими посттрансляционными модификациями [24]. Однако такая каноническая функция белка была поставлена под сомнение с открытием того, что цитохром С высвобождается из митохондрий в цитозоль при обработке клеток индуктором апоптоза. Несмотря на то что митохондрии являются ключевыми для контроля гомеостаза и судьбы клетки, их роль в реакции повреждения ДНК обычно рассматривается просто как триггер апоптоза. Однако появляется все больше свидетельств того, что митохондриальные факторы модулируют ядерные функции. Примечательно, что после повреждения ДНК цитохром С взаимодействует в ядре клетки со множеством хорошо известных шаперонов гистонов, активность которых конкурентно ингибируется белком-переносчиком гема 1. Поскольку цитохром C подавляет активность сборки/разборки гистоновых шаперонов в нуклеосомах, это действительно может влиять на динамику хроматина и отложение гистонов в ДНК [25].

Заключение. В представленном исследовании определены межполовые особенности митохондриальной локализации цитохрома С в различных отделах кишечника. При этом общим патологическим признаком, характеризующим митохондрии опухолевых клеток всех отделов кишечника, явилось высокое содержание цитохрома С, что возможно связано с интенсификацией процессов клеточного дыхания в опухоли для усиления ее роста. Полагаем, что обнаруженные межполовые и межтканевые особенности распределения цитохрома С в митохондриях клеток тканей кишки и опухоли могут способствовать лучшему прогнозированию течения и исхода колоректального рака в зависимости от пола больных.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Научное редактирование: Кит О.И.

Написание текста, анализ и интерпретация данных: Франциянц Е.М.

Проверка критически важного интеллектуального содержания: Ильченко С.А.

Анализ и интерпретация данных: Бандовкина В.А.

Техническое редактирование, оформление библиографии: Нескубина И.В.

Статистическая обработка данных: Петрова Ю.А.