Особенности развития фиброза печени на фоне формирования синдрома дистрофическиqдегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе

Фиброз печени характеризуется избыточным развитием соединительной ткани в результате повторных и/или длительных повреждений, воздействующих на орган. При его развитии преимущественно нарастает содержание коллагенов I, V, VI типов, ламинина, эластина, гликозаминогликанов [3].

В настоящее время является установленной следующая последовательность развития фиброза печени. Так, при гепатитах различной этиологии в результате повреж- дения гепатоцитов из них выделяются различные биологически активные вещества, включающие перекиси и протеазы. Эти вещества активируют макрофаги печени, а также эндотелий синусоидов. Активированные клетки, в свою очередь, начинают секретировать биологически активные вещества, вызывающие активацию звездчатых клеток. К разряду подобных веществ относятся провос-палительные цитокины – интерлейкин-1 (IL-1), фактор некроза опухоли альфа (TNFα), перекиси, оксид азота, эндотелин, но главная роль в активации звездчатых клеток принадлежит тромбоцитактивирующему фактору

(PDGF), активатору плазминогена, трансформирующему фактору роста бета 1 (TGF β 1). Под их воздействием звездчатые клетки выходят из состояния покоя, становятся активированными и трансформируются в миофиброб-ластоподобный фенотип, приобретая способность к продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса, в том числе коллагена и протеогликанов. Однако вопрос возможности развития фиброзных изменений на фоне формирования синдрома дистрофически-дегенератив-ных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе остается открытым, поскольку в этом случае выраженных деструктивных изменений гепатоцитов не наблюдается. В этой связи является актуальным изучение возможности развития фиброза печени путем задействования дополнительных альтернативных механизмов.

Материал и методы

Эксперимент проведен на 18 половозрелых крысах-самцах Вистар с исходной массой 180–220 г, у 12 из которых с помощью Золотистого стафилококка (штамм 209) воспроизведена адаптированная для мелких лабораторных животных модель вторичной дезорганизации соединительной ткани [1]. Животных выводили из эксперимента через 2 и 3 мес. Группу контроля составляли 6 интактных животных. Эксперимент выполнялся с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.

Объекты печени фиксировали в 12% формалине и жидкости Теллесницкого. Из залитых в парафин объектов делали серийные срезы толщиной 7 мкм. Коллагеновые волокна выявлялись пикрофуксином по Ван Гизону; сульфатированные гликозаминогликаны – альциановым синим при рН 1,0; популяция тучных клеток оценивалась после окраски препаратов альциановым синим при рН 1,25 без или с последующей докраской кармалюмом Майера. Популяция звездчатых клеток печени оценивалась на полутонких срезах, окрашенных толуидиновым синим. Для изучения маркера пролиферации Ki-67 (белка, эксп-рессирующегоуся на всех стадиях клеточного цикла, кроме G0) использовали двухэтапный иммуногистохимический метод.

С помощью программного обеспечения ImageJ 1.42g (National institutes of Health, USA) определялась площадь, занимаемая коллагеновыми волокнами и сульфатированными гликозаминогликанами в области триад, образованных вокругдольковыми и междольковыми сосудами. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы STATISTICA 6.0: высчитывали средние величины (M) и их стандартные ошибки (m). Достоверность различий оценивали с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни при 95-процентном уровне значимости.

Результаты и обсуждение

На срезах печени через 2 мес. после воспроизведения очага хронического воспаления, окрашенных пик-рофуксином по Ван Гизону, отмечалось достоверное увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных как мелкими (вокругдольковыми) сосудами на 161,4%, так и более крупными (междольковыми) сосудами – на 98,8% по сравнению с интактными животными, таблица.

При окраске альциановым синим отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных междольковыми сосудами на 37,6% по сравнению с интактными животными. При этом достоверных отличий в распределении хондроитинсульфатов в области триад, образованных более мелкими (вокругдольковыми) сосудами не отмечалось.

Необходимо отметить, что в печени данной группы крыс отмечалось достоверное увеличение популяции звездчатых клеток по сравнению с интактными животными (на 220,0%), рисунок 1.

Таблица

Площади коллагеновых волокон и сульфатированных гликозаминогликанов в области портальных трактов, стенках и окружении центральных вен в мкм2 (M±m)

Примечание: * – значимость различий с интактными животными при р<0,05.

Вместе с тем при изучении экспрессии маркера пролиферативной активности клеток отмечалось некоторое увеличение количества фибробластов, экспрессирующих Ki-67 в ядрах, что могло свидетельствовать о начале развития фиброзных процессов. При оценке популяции тучных клеток на срезах, окрашенных альциановым синим при рН 1,25, было отмечено возросшее, по сравнению с контролем, количество масто-цитов в области триад.

Через 3 мес. после воспроизведения модели на срезах печени, окрашенных пикрофуксином по Ван Гизону, отмечалось выраженное, более чем в 10 раз увеличение площади коллагеновых волокон межклеточного вещества соединительной ткани в области триад, образованных мелкими (вокругдольковыми) сосудами. В междольковых сосудах площадь коллагеновых волокон возрасла более чем в 6 раз по сравнению с интактными животными. На срезах, окрашенных альциановым синим, в отличие от предыдущего срока отмечалось достоверное увеличение площади сульфатированных гликозаминогликанов основного вещества соединительной ткани в области триад, образованных вокругдольковыми сосудами на 20,9% по сравнению с интактными животными. Распределение хондроитинсульфатов в области триад, образованных более крупными (междольковыми) сосудами также было достоверно увеличенным (на 29,0%). Морфометрическая оценка популяции звездчатых клеток позволила выявить их достоверное увеличение по сравнению с интактными животными (на 230,1%).

При оценке маркера пролиферативной активности клеток отмечалось существенное увеличение количества фибробластов, экспрессирующих Ki-67 в ядрах, что может свидетельствовать о развитии фиброзных процессов. При этом количество тучных клеток в области триад сохранялось существенно повышенным.

Достаточно существенным является тот факт, что при персистенции бактериальной инфекции наблюдается морфологическая картина сочетания венулярного и пе-рипортального фиброза. Не исключено, что это может быть связано как с теми биологически активными веществами, которые в большом количестве присутствуют в крови при воспалительном процессе, так и с цитокинами клеток воспалительных инфильтратов, локализованных в портальных трактах. При других вариантах развития фиброза печени, когда синтез коллагена осуществляется преимущественно клетками Ито, расположенных в пространстве Диссе, отмечается, особенно на начальных этапах, перицеллюлярный фиброз [3].

Определенную роль в развитии фиброза печени при персистенции бактериальной инфекции, по-видимому, играет наблюдаемая нами рекрутизация тучных клеток в портальные тракты. На эту возможность обращается внимание в ряде исследований, посвященных изучению взаимодействия мастоцитов и фибробластов при других па-

произведении модели вторичной дезорганизации соединительной ткани на площади 500000 мкм2

тологических состояниях [5, 8], при этом отмечается, что тучные клетки могут стимулировать как пролиферативную активность фибробластов, так и выработку ими внеклеточного матрикса [4, 6, 7].

Заключение

Таким образом, настоящее исследование позволило выявить некоторые особенности развития фиброза печени при формировании синдрома дистрофически-де-генеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе. Так, наряду с классическим вариантом развития фиброза, реализующимся вследствие активации макрофагами звездчатых клеток печени, присутствует альтернативный механизм, заключающийся в активировании фибробластов портальных трактов тучными клетками. Это может быть связано, с одной стороны, с умеренными деструктивными процессами в паренхиме печени, что не позволяет в полной мере реализоваться классическому варианту. С другой стороны, при наличии очага хронического воспаления происходят вторичные изменения мезенхимальных производных, выражающиеся в разрастании соединительной ткани в органах с достаточной васкуляризацией, в отличие от брадитрофных тканей, где преобладают дистрофически-дегенеративные изменения [2]. Полученые данные подтверждают возможность участия тучных клеток в процессе развития фиброза печени при наличии отдаленного очага хронической инфекции. Это может служить поводом к поиску специальных методов защиты паренхиматозных органов при развитии синдрома сочетанных дистрофически-дегенеративных изменений мезенхимальных производных при локальном хроническом воспалительном процессе.