Особенности соотношения локального содержания продуктов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты при апикальном периодонтите

Актуальность. На сегодняшний день заболевания периодонта занимают третье место по частоте обращаемости после кариеса и пульпита. Острые и хронические очаги инфекции в периапикальных тканях являются наиболее частой причиной потери функционально пригодных зубов у людей молодого и среднего возраста, а также представляют серьезную угрозу для развития гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области [3, 6, 10, 18, 19].

Несмотря на то, что за последние три десятилетия была получена значительная по объему информация о патобиологической природе апикального периодонтита, расширение представления о патогенезе данного заболевания сохраняет свою актуальность [3]. Одним из важнейших факторов в развитии периодонтитов является микробный фактор. Сформировалось мнение, что если между полостью рта и корневым каналом существует сообщение, то в нем развивается бактериальная флора, способная вызывать деструктивные изменения в периодонте [10]. Особые условия корневого канала стимулируют рост некоторых видов бактерий, большая часть которых является представителями облигатно-анаэробных групп (бактероиды, фузо-бактерии, пептострептококки); также методом генодиагностики были выделены труднокультиви-руемые виды вирулентных анаэробных возбудителей (Prevotella intermedia, Prevotella endodontis, Porphyromonas spp.) [5, 6].

В современном представлении патогенеза апикального периодонтита помимо микробного фактора равноценное значение придается различным защитным механизмам [3, 6, 19]. К ним относятся клеточные элементы (нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты, плазматические клетки и прочие), молекулярные медиаторы, прежде всего цитокины [3, 6, 11, 14, 22, 23].

Таким образом, в настоящее время апикальный периодонтит рассматривается как защитная реакция организма на разрушение пульпы зуба и «враждебную оккупацию» системы корневых каналов. Микробным клеткам противостоят иммунные механизмы, избыточная активация которых чревата развитием дополнительной альтерации периапикальной зоны, в результате чего развиваются различные типы поражений, свойственные апикальному периодонтиту [2, 3]. Однако известно, что любое воспаление, вызванное бактериальной инфекцией, сопровождается усилением свободнорадикального окисления [2, 8, 21]. Данные последних лет свидетельствуют, что активация свободнорадикального окисления играет существенную роль в развитии осложнений при периодонтите [15]. Тем не менее наблюдается дефицит экспериментальных и клинических исследовательских работ, посвященных изучению соотношения продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и параметров антиоксидантной защиты (АОЗ) при различных формах апикального периодонтита. Указанные предпосылки определили цель и направления настоящего исследования.

Цель исследования состояла в изучении соотношения продуктов липопероксидации и антиоксидантной защиты в локальном очаге периапикального воспаления.

Материалы и методы исследования. За период c 2009 по 2011 годы на базе кафедры биохимии и стоматологии Челябинской государственной медицинской академии (ГБОУ ВПО «ЧелГМА Минздравсоцразвития России») было проведено экспериментально-клиническое исследование.

Экспериментальный периодонтит был моделирован по методу, описанному Наибовым О.В. (2007) [9]. Исследования выполняли у 49 белых беспородных половозрелых крыс-самцов массой 220–260 грамм, содержащихся в стандартных условиях и получающих общепринятый пищевой рацион. Контроль представили 7 особей. Объектом изучения были периапикальные ткани травмированного коренного зуба.

Материалом для клинической части исследования была нестимулированная смешанная слюна стоматологических пациентов [17], которая, как известно, релевантно отражает изменения в местном периапикальном воспалительном очаге. Было обследовано 76 пациентов, обращавшихся за стоматологической помощью в плановом и экстренном порядке. Контрольную группу составили 16 клинически здоровых человек, с санированной полостью рта, сопоставимых по полу, возрасту, месту проживания, соответствующих критериям включения.

Критериями включения в исследование были: мужской и женский пол; возраст от 18 до 74 лет; наличие не более одного очага одонтогенной инфекции при стоматологически санированной ротовой полости, индекс зубного налета не более 1,5, индекс зубного камня не более 1,0 (критерии индекса Green – Vermillion); отсутствие в полости рта ортопедических конструкций; отсутствие острых и обострения хронических заболеваний полости рта и носоглотки в течение 3-х последних месяцев; отсутствие общих соматических заболеваний, в том числе декомпенсированной и/или некомпенсированной патологии сердечно-сосудистой системы, пищеварительной, бронхолегочной системы, гепатобилиарного и урогенитального тракта; отсутствие вредных привычек; информированное согласие больного на проведение обследования.

Пациенты были разделены на три группы в зависимости от длительности и тяжести воспалительных явлений в периапикальных тканях причинного зуба. В 1-ю группу, n = 34 человека (45 %), были включены больные с острым апикальным периодонтитом (К04.4) [7], что соответствовало острому периодонтиту в фазу интоксикации [18]. 2-я группа, n = 14 человек (18 %) – пациенты с хроническим апикальным периодонтитом (К04.5) [7], что соответствует деструктивным формам хронического периодонтита [18, 20]. 3-я группа, n = 28 (37 %) – больные с периапикальным абсцессом без свища – 25 пациентов и периапикальным абсцессом со свищом – 3 человека (К04.7) [7], что соответствует обострению хронических деструктивных форм периодонтитов [18, 20]. Средний возраст пациентов составил 39 ± 5,1 лет. Пациенты, распределенные в различные группы, были сопоставимы по полу и возрасту. Стоматологическое обследование проводили в соответствии с протоколом обследования стоматологического пациента [12, 18]. После забора материала для исследования пациентам проводилось лечение по общепринятыми методиками [6, 18].

Биохимические показатели изучали в тканях периапикального воспаления крыс и в слюне пациентов с различными формами апикального периодонтита. Содержание продуктов ПОЛ оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых биологических сред, с выделением гептан- и изопропанолрастворимых липоперокси-дов (рассчитывали в единицах индекса окисления, е.и.о.: Е 232/220 – относительное содержание диеновых конъюгатов, Е 278/220 – уровень кетодиенов и сопряженных триенов) [20]. Определение конечных продуктов периокисления липидов (Е 400/220 – шиффовы основания) и интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ (индукция Fe²⁺/аскор-бат) (е.и.о.) производилось спектрофотометрическим методом [16]. Содержание окислительно-модифицированных (кар бонилированных) белков (мкмоль/г ткани; мкмоль/г белка) определяли по методике Е.Е. Дубининой [1].

Помимо изучения свободнорадикального профиля, проводили гистологическое исследование периапикальных тканей экспериментальных животных [13] – в резецированных в зоне моделирования периодонтита фрагментах посуточно определяли численность нейтрофильных гранулоцитов, макрофагов и лимфоцитов (ед./мм2).

Полученные результаты обрабатывались пакетом статистических программ Statistica 6,0 for Windows с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М ± m). Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при Р ≤ 0,05. О значимости различий показателей в сравниваемых группах судили по непараметрическим критериям Манна–Уитни (U), Вальда–Вольфовица (WW). Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчет коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs) и Кенделлу (Rк).

Результаты исследования и их обсуждение. В результате экспериментального моделирования апикального периодонтита по данным гистологического исследования в 1-е сутки после альтерации в периапикальных тканях наблюдалась лейкоцитарная инфильтрация. Это проявлялось в трёхкратном приросте количества (ед./мм²) нейтрофилов, моноцитов/макрофагов (P = 0,03U) и пятикратном увеличении числа лимфоцитов (P = 0,005U) в тканях периодонта по сравнению с контрольными животными. Данные изменения сохранялись в период со 2-х по 4-е сутки. На 5-е сутки содержание лейкоцитов в периапикальных тканях статистически значимо не отличалось от контрольного уровня. Однако, начиная с 6–7-х суток, отмечено появление «второй волны лейкоцитарной инфильтрации». Это проявлялось в четырёхкратном приросте содержания нейтрофилов, моноцитов на

6-е сутки (P = 0,01U) и в пятикратном приросте на 7-е сутки (P = 0,005U) при четырёхкратном увеличении содержания лимфоцитов на 6-е сутки (P = 0,01U) и трёхкратном увеличении на 7-е сутки (P = 0,028U).

Выявленный в процессе морфологических исследований волнообразный рост клеток, вероятно, связан с фазами течения периодонтита. В первые сутки после травмирования периапикальных тканей зуба у крыс формировался острый апикальный периодонтит, для которого характерно увеличение числа лейкоцитов в зоне воспаления [11]. В дальнейшем (на 6–7-е сутки) под действием микробных агентов и протекторных противоинфекцион-ных факторов (вторичная альтерация тканей периодонта) в очаге наблюдалась хронизация острого воспаления, также сопровождающаяся увеличением числа лейкоцитов [4].

Серия биохимических исследований в эксперименте показала, что первичному развитию лейкоцитарного инфильтрата соответствовало двухкратное увеличение содержания карбонилиро-ванных белков c 0,166 ± 0,026 мкмоль/г белка (n = 7) до 0,387 ± 0,014 мкмоль/г белка (n = 7; P = 0,047U) на фоне увеличения содержания геп-танрастворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов (табл. 1). При этом наблюдалось снижение содержания изопро-панолрастворимых диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряжённых триенов с последующим переходом их во фракции неполярных липидов (табл. 2). Известно, что в гептановой фазе детектируются продукты переокисления эйкозаноидов, играющие важную роль в развитии воспалительного инфильтрата [20]. Следует отметить, что на 5-е сутки от начала воздействия наблюдалось усиление Fe⁺²/H 2 O 2 индуцированного карбонилирования белков с 6,23 ± 0,052 мкмоль/г ткани (n = 7) до 7,11 ± 0,034 мкмоль/г ткани (n = 7; P = 0,028WW). На 10-е сутки было отмечено увеличение содержания карбонилированных белков c 7,95 ± 0,33 мкмоль/г ткани до 8,55 ± 0,64 мкмоль/г ткани

(P = 0,028WW). При этом уровень молекулярных продуктов ПОЛ в эти сроки не претерпел статистически значимых изменений.

Обращает на себя внимание наличие положительных корреляционных связей между содержанием гептанрастворимых кетодиенов и сопряжённых триенов с количеством моноцитов воспалительного очага (Rs = 0,794; P = 0,024), а также между содержанием этих же продуктов ПОЛ и числом лимфоцитов в тканях очага (Rs = 0,689; P = 0,034). Кроме того, отмечено наличие положительной корреляции между содержанием карбони-лированных белков и количеством лимфоцитов в лейкоцитарном инфильтрате (Rs = 0,756; P = 0,026). Данные корреляционные связи могут отражать способность молекулярных продуктов липоперок-сидации выступать в роли хемоаттрактантов для лейкоцитарных клеток [9].

Известно, что саливаторные показатели вполне корректно отражают изменения в локальном очаге одонтогенного воспаления. Поэтому на следующем этапе исследования мы провели изучение биохимических показателей слюны пациентов с различными клиническими формами апикального периодонтита.

В 1-й группе пациентов (с острым апикальным периодонтитом) наблюдалось увеличение уровня Fe+2/аскорбат индуцированного ПОЛ и содержания карбонилированных белков, а также гептанрастворимых продуктов ПОЛ (табл. 3). Было определено снижение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов. Исследование показателей больных с хроническим апикальным периодонтитом (2-я группа) выявило существенное превышение содержания карбонилированных белков. При этом снижалось содержание изопро-панолрастворимых кетодиенов и сопряжённых триенов на фоне прироста содержания Fe2+/аскор-батиндуцированного ПОЛ. Для периода обострения хронического апикального периодонтита (3-я группа пациентов) характерно увеличение содер-

Таблица 1

Содержание гептанрастворимых молекулярных продуктов ПОЛ в периапикальных тканях в динамике экспериментального периодонтита

Показатель (е.и.о.)	ДК	КД и СТ	ШО
Контроль (n = 7)	0,416 ± 0,0021	0,085 ± 0,0013	0,015 ± 0,001
1 сутки (n = 7)	0,423 ± 0,0014*	0,096 ± 0,0011*	0,014 ± 0,003
2 сутки (n = 7)	0,418 ± 0,0036	0,093 ± 0,001*	0,012 ± 0,004
3 сутки (n = 7)	0,417 ± 0,0027	0,094 ± 0,0009*	0,012 ± 0,004
4 сутки (n = 7)	0,419 ± 0,0036	0,094 ± 0,0009*	0,014 ± 0,006
5 сутки (n = 7)	0,415 ± 0,0046	0,088 ± 0,001	0,014 ± 0,004
6 сутки (n = 7)	0,411 ± 0,0034	0,085 ± 0,0014	0,005 ± 0,0004*
7 сутки (n = 7)	0,412 ± 0,0076	0,085 ± 0,001	0,014 ± 0,004
10 сутки (n = 7)	0,426 ± 0,0031	0,081 ± 0,0014	0,006 ± 0,0002**

Примечание. В табл. 1–3 статистическая разница различий с контролем * – P ≤ 0,05; ** – P ≤ 0,005, критерий Манна–Уитни. ДК – диеновые коньюгаты, Е 232/220 ; КД и СТ – кетодиены и сопряженные триены, Е 278/220 ; ШО – шиффовы основания, Е 400/220 .

Таблица 2

Содержание изопропанолрастворимых молекулярных продуктов ПОЛ периапикальных тканей в динамике экспериментального периодонтита

Показатель (е.и.о.)	ДК	КД и СТ	ШО	КД и СТ (индукция Fe2+/аскорбат)
Контроль (n = 7)	0,808 ± 0,035	0,155 ± 0,021	0,0054 ± 0,001	1,25 ± 0,057
1 сутки (n = 7)	0,656 ± 0,068**	0,116 ± 0,015*	0,022 ± 0,008**	1,58 ± 0,084**
2 сутки (n = 7)	0,797 ± 0,048*	0,157 ± 0,044	0,14 ± 0,004*	1,28 ± 0,092*
3 сутки (n = 7)	0,703 ± 0,024	0,15 ± 0,041	0,09 ± 0,005	1,27 ± 0,092
4 сутки (n = 7)	0,801 ± 0,032	0,153 ± 0,017	0,052 ± 0,001	1,4 ± 0,15
5 сутки (n = 7)	0,815 ± 0,04	0,155 ± 0,065	0,053 ± 0,001	1,27 ± 0,15
6 сутки (n = 7)	0,755 ± 0,014**	0,147 ± 0,015*	0,022 ± 0,0087*	1,4 ± 0,015**
7 сутки (n = 7)	0,801 ± 0,053	0,151 ± 0,031	0,09 ± 0,001	1,31 ± 0,057**
10 сутки (n = 7)	0,839 ± 0,01	0,165 ± 0,021	0,0021 ± 0,001*	1,28 ± 0,53

Таблица 3

Содержание молекулярных продуктов ПОЛ и карбонилированных белков в слюне пациентов с апикальным периодонтитом

Показатель	Клинически здоровые лица (n = 16)	Стоматологические пациенты (n = 76)
Группа 1 (n = 34)
КД и СТ [г] (е.и.о.)	0,122 ± 0,028	0,173 ± 0,017*
КД и СТ [и] (е.и.о.)	0,402 ± 0,023	0,276 ± 0,044*
КД и СТ (е.и.о.) (индукция Fe2+/аскорбат)	0,894 ± 0,06	1,057 ± 0,03*
ОМБ (мкмоль/гр. белка)	1,47 ± 0,19	4,55 ± 0,29*
Группа 2 (n = 14)
КД и СТ [и] (е.и.о.)	0,402 ± 0,023	0,32 ± 0,024*
КД и СТ (е.и.о.) (индукция Fe2+/аскорбат)	0,894 ± 0,06	0,94 ± 0,041*
ОМБ (мкмоль/гр. белка)	3,82 ± 0,19	7,16 ± 0,53*
Группа 3 (n = 28)
КД и СТ (е.и.о.) (индукция Fe2+/ аскорбат)	0,894 ± 0,06	0,97 ± 0,035*
ШО [и] (е.и.о.)	0,14 ± 0,017	0,185 ± 0,01*
ОМБ (мкмоль/гр. белка)	1,81 ± 0,14	1,03 ± 0,24*

Примечание. [г] и [и] обозначают продукты ПОЛ, извлекаемые соответственно гептановой и изопро-панольной фазами; ОМБ – продукты окислительной модификации белка.

жания изопропанолрастворимых шиффовых оснований и уровня Fe2+/аскорбатиндуцированного ПОЛ. Интересно отметить, что во время обострения обнаружено снижение содержания карбонили-рованных белков. То есть полученные результаты свидетельствуют об усилении липопероксидации в период обострения и об увеличении уровня карбо-нилированных белков при его отсутствии. Примечательно, что в период ремиссии апикального периодонтита в воспалительном очаге наблюдалось не только усиление окислительной деструкции белков, но и снижение содержания молекулярных продуктов ПОЛ.

Заключение. Резюмируя полученные в исследовании данные, можно заключить, что результаты эксперимента, соотносятся с саливаторными показателями пациентов с апикальным периодонтитом. Показатели локального очага воспаления в 1-е и 2-е сутки экспериментального периодонтита, также как и данные исследования слюны пациентов с острым апикальным периодонтитом, продемонстрировали усиление ПОЛ на фоне одновременного увеличения окисляемости липидов и увеличения содержания карбонилированных белков, среди которых имеются вещества, обладающие антиоксидантной активностью. Для хронического периодонтита характерно увеличение содержания карбонилированных белков и снижение содержания изопропанолрастворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов. Аналогичные изменения были выявлены соответственно на 10-е и 6-е сутки эксперимента. При этом гистологические исследования, проводимые в эти сроки, зафиксировали координированные с динамикой биохимических показателей морфологические изменения, связанные с увеличением соединительно-тканных компонентов, что, вероятно, характеризует благоприятное течение хронических форм апикального периодонтита [4, 12]. Обращает на себя внимание наличие положительной корреляции между содержанием карбонилирован-ных белков и содержанием соединительно-тканных элементов. Вполне возможно, что усиление карбонилирования белков способствует образованию экстрацеллюлярных белковых агрегатов. Аналоги результатов исследования пациентов третьей группы в эксперименте отсутствуют, однако выявленное снижение содержания карбонилированных белков в слюне при обострении хронического периапикального процесса может служить критерием усугубления тяжести заболевания.