Особенности токсического действия гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты и обоснование регламентов его безопасного производства и применения

Перспективным направлением интенсификации сельскохозяйственного производства является применение регуляторов роста растений, которые дополняют эффективность использования удобрений и пестицидов. Регуляторами роста являются физиологически активные вещества природного или синтетического происхождения, которые путем воздействия на интенсивность и направленность процессов морфогенеза растений способствуют увеличению продуктивности растениеводства.

Развивая это направление, в Институте биоорганической химии НАН Беларуси создан новый регулятор роста растений на основе гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты (ГЭ-АЛК) [8], который оказывает эффективное стимулирующее действие на рост и развитие ряда сельскохозяйственных культур, а также повышает устойчивость растений к неблагоприятным условиям культивирования [3, 11, 12].

Для обеспечения безопасного опытнопромышленного синтеза и применения нового препарата необходимо осуществление его полной токсикологической оценки с обоснованием необходимых регламентов содержания в объектах среды обитания человека. Вышеизложенное

свидетельствует об актуальности комплексных токсикологических исследований по оценке степени токсичности и опасности ГЭ-АЛК, установлению токсикодинамики и возможных механизмов вредного действия препарата на организм, обоснованию лимитирующих показателей вредности.

Цель работы – установить особенности токсического действия ГЭ-АЛК на экспериментальных моделях in vivo / in vitro и обосновать комплекс гигиенических нормативов, обеспечивающих его безопасное производство и применение.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования, основанные на методических документах [5, 13, 14], проведены на 200 нелинейных белых мышах (17–23 г), 325 рандом-бредных белых крысах (180–210 г) и 3 белых кроликах (4,2–4,5 кг).

При проведении токсикологических исследований моделировали острые, подострые и хронические формы отравлений. В острых опытах параметры токсикометрии ГЭ-АЛК определяли при внутрижелудочном, эпикутанном, ингаляционном путях поступления в организм с последующим расчетом летальных доз методом пробит-анализа и определением величин показателей потенциальной опасности острого отравления. Способность к кумуляции в подострых опытах при внутрижелудочном введении и характер кожно-резорбтивного действия устанавливали на белых крысах в повторных 30-дневных опытах. Хронический эксперимент проведен на белых крысах, которым внутрижелудочно на протяжении 6 месяцев вводили ГЭ-АЛК в дозах 110, 30 и 11 мг/кг. Исследования и процедуры выполнены согласно руководствам и нормативным документам (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96; Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных или в иных научных целях (ETS № 123); Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. Правила лабораторной практики (GLP)). Животных выводили из эксперимента с соблюдением требований Международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1997).

Изучение сенсибилизирующей активности, раздражающего действия ГЭ-АЛК на слизистые оболочки глаза и на неповрежденные кожные покровы проводили в соответствие с инструкцией № 1.1.11–12–35–2004 [14].

Влияние ГЭ-АЛК на репродуктивную функцию белых крыс изучали по методу А.А. Динер- ман [4]. Для оценки мутагенной активности использовали тест Эймса [17] и цитогенетический метод хромосомных аберраций на лимфоцитах периферической крови человека [18]. Цитотоксические свойства ГЭ-АЛК изучали с использованием перевиваемых культур эмбриональных фибробластов человека (ЭФЧ) и аденокарциномы легкого человека А-549, культивируемых по методике L. Hayflick, P. S. Moorhead [19].

Для оценки состояния детоксикационной монооксигеназной системы использовали микросомальную фракцию печени белых крыс [20], в которой определяли содержание цитохромов Р450 и Р420, активность Р450-редуктазы, кинетические параметры ( К m , V max ) реакций окисления 7-этоксикумарина и 7-этоксирезоруфина.

Изучение структурно-функциональных свойств мембран осуществляли с применением флуоресцентного зонда пирена, вносимого в суспензию теней эритроцитов белых крыс при воздействии ГЭ-АЛК в опытах in vivo и in vitro [2].

Результаты исследований обрабатывали общепринятыми методами. Различия между контрольными и опытными группами считались статистически значимыми при р <0,05.

Результаты токсиколого-гигиенической оценки нового соединения могут впоследствии использоваться для установления параметров безопасности по критериям допустимого риска.

Результаты и их обсуждение. При однократном внутрижелудочном введении ГЭ-АЛК белым мышам и крысам обоего пола установлены основные количественные параметры токсичности (DL 16 , DL 50 , DL 84 ) и опасности (S, R), которые не имеют видовых (коэффициент видовой чувствительности – 2,6) и половых различий и позволяют отнести препарат к умеренно опасным соединениям (таблица) [10].

В условиях моделирования острого ингаляционного отравления при максимально достижимой концентрации ГЭ-АЛК признаки интоксикации и гибель белых мышей отсутствовали, как и при однократном нанесении 50%-ного раствора на кожу белых крыс в дозе 800 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии опасности острых отравлений при указанных путях воздействия.

При однократной инстилляции 50 мкл 50%-ного раствора ГЭ-АЛК в нижний конъюнктивальный свод правого глаза кроликов наблюдали обильное слезотечение, умеренное покраснение сосудов конъюнктивы, отек век и блефароспазм, что позволяет отнести его к веществам

Параметры токсичности и потенциальной опасности острого отравления ГЭ-АЛК

Вид животных	Величина летальной дозы, мг/кг			Показатель потенциальной опасности острого отравления
	DL 16	DL 50	DL 84	S	R
Мыши, самцы	2540	3000 (2630÷3420)	3540	1,18 (0,99÷1,4)	1,39
Мыши, самки	2470	3170 (2710÷3710)	3900	1,26 (1,13÷1,41)	1,58
Крысы, самцы	6350	8800 (6560÷11800)	12500	1,41 (0,97÷2,0)	1,97
Крысы, самки	4800	7800 (5740÷10600)	12600	1,62 (1,12÷2,35)	2,63

П р и м е ч а н и я :

1. DL 16 , DL 50 , DL 84 – дозы, вызывающие 16 %, 50 %, 84 % летальных исходов.

2. S – функция угла наклона прямой «доза – эффект».

3. R – размах летальных доз.

с выраженным ирритативным действием. Признаки раздражающего действия препарата при однократном контакте с неповрежденными кожными покровами белых крыс отсутствовали.

Сенсибилизирующая способность ГЭ-АЛК, изученная в опытах на белых мышах на модели воспроизведения гиперчувствительности замедленного типа, не выявлена.

При внутрижелудочном введении самцам белых крыс ГЭ-АЛК в течение 30 суток наличие смертельных эффектов на уровне 1/5 DL50 позволило рассчитать коэффициент кумуляции, равный 1,6, который характеризует препарат как высококумулятивное соединение. Наиболее выраженные изменения зарегистрированы при внутрижелудочном введении белым крысам ГЭ-АЛК в течение 30 суток в дозе 880 мг/кг (1/10 DL50) в виде статистически значимых сдвигов поведенческой активности, увеличения суммационно-порогового показателя (СПП) на 78 % и относительных коэффициентов массы (ОКМ) внутренних органов – печени, сердца, легких, селезенки, почек и надпочечников. Со стороны гематологических показателей выявлено достоверное по сравнению с контролем снижение концентрации гемоглобина на 13 % и оксигемоглобина на 14 %, количества эритроцитов на 15 %, гематокрита на 12 %. О нарушении кислотно-основного состояния крови свидетельствует достоверное по сравнению с контролем снижение парциального давления кислорода на 24 %, увеличение парциального давления углекислого газа на 14 % и бикарбо-натной емкости крови на 13 %. В сыворотке крови белых крыс обнаружено повышение уровня активности гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТ) в 1,5 раза (р<0,05), аланинаминотрансферазы (АЛТ) – в 2,3 раза (р<0,05), увеличение содержания общего билирубина – в 2,0 раза (р<0,05), компонента комплемента С3 – в 1,5 раза и иммуноглобулина G – на 28 % (р<0,05) по отношению к контролю. Наличие гиперфер-ментемий, патофизиологической основой которых является повреждение мембран гепатоцитов, указывает на мембраноповреждающее действие соединения.

При субхроническом внутрижелудочном введении ГЭ-АЛК в дозе 440 мг/кг (1/20 DL 50 ) у подопытных крыс наблюдали изменения двигательной активности и увеличение СПП на 60 % ( р <0,05). По окончании эксперимента у подопытных животных зарегистрировано увеличение ОКМ сердца, почек и надпочечников ( р <0,05), снижение в периферической крови концентрации гемоглобина на 9 % и повышение уровня общего билирубина в 1,6 раза по сравнению с контролем ( р <0,05). При снижении вводимой дозы ГЭ-АЛК до 110 мг/кг (1/80 DL 50 ) выявлено лишь увеличение содержания в сыворотке крови белых крыс общего билирубина в 1,3 раза по отношению к контролю ( р <0,05).

Изучение кожно-резорбтивных свойств ГЭ-АЛК в виде 50%-ного раствора (864 мг/кг) в условиях 30-кратных аппликаций на кожу спины белых крыс не выявило внешних признаков интоксикации и гибели животных. Однако у животных наблюдалось повышение ферментативной активности АЛТ на 21,6 % ( р <0,05) и увеличение содержания мочевины на 22 % ( р <0,05) в сыворотке крови, снижение рН мочи до 6,0 ( р <0,05) по отношению к таковым в контрольной группе. Эпикутанное воздействие 25%-ного раствора ГЭ-АЛК в дозе 341 мг/кг приводило к увеличению активности АЛТ в сыворотке крови белых крыс на 29,6 % ( р <0,05). При снижении уровня воздействия ГЭ-АЛК до 75 мг/кг (5%-ный раствор) изменения биохимических показателей не выявлены.

Проведение регламентации нового регулятора роста растений требует определения его влияния на репродуктивную функцию и изучение мутагенного действия [5].

Однократное внутрижелудочное введение препарата самкам белых крыс в дозе 1/2 DL50 (3900 мг/кг) в периоды интенсивного органогенеза вызывало клинические проявления инток- сикации, однако гибели эмбрионов и признаков тератогенного действия не обнаружено. Пре-имплантационная смертность у экспериментальных животных выражена незначительно. Постимплантационная смертность в опытных группах и контроле отсутствует. Для процессов постнатального развития наиболее критичным оказалось воздействие препарата на 9-й день беременности, о чем свидетельствует отставание физического развития крысят на 13 % по массе и на 5 % по длине тела (р<0,05). Полученные данные указывают на умеренную репродуктивную токсичность ГЭ-АЛК. При многократном воздействии в течение всей беременности в дозе, кратной 1/40 DL50 (195 мг/кг), изучаемое соединение не проявляет эмбрио-тропного и тератогенного действия, не оказывает отрицательного влияния на постнатальное развитие потомства.

В условиях субхронического внутрижелу-дочного введения самцам белых крыс в дозе 440 мг/кг (1/20 DL₅₀) ГЭ-АЛК проявляет слабое гонадотоксическое действие по морфофункциональным показателям гонад, что выражалось увеличением ОКМ семенников на 12 % ( р <0,05) и снижением времени движения сперматозоидов в 1,6 раза ( р <0,05) по отношению к контролю. При снижении вводимой дозы до 110 мг/кг указанные изменения отсутствовали.

Таким образом, эмбриотропный и гонадотропный эффекты воздействия зарегистрированы только на фоне поступления массивных доз препарата, приводящих к интоксикации родительских организмов, что позволяет рассматривать изменения в показателях репродуктивной системы как признаки проявления общетоксического действия ГЭ-АЛК [9].

Потенциальной мутагенной активности ГЭ-АЛК в концентрациях 1 и 10 мкг/мл в тесте Эймса на штамме S. typhimurium ТА 100 в условиях с метаболической активацией и без нее не установлено, как и в цитогенетическом тесте на периферических лимфоцитах человека in vitro при уровнях воздействия 0,05, 0,1 и 0,25 мг/мл [1].

Для выявления механизма токсического действия ГЭ-АЛК изучено состояние детоксикационной монооксигеназной системы печени белых крыс при субхроническом внутрижелу-дочном введении дозы 440 мг/кг. Установлено достоверное увеличение удельного содержания цитохрома Р450 в 1,4 раза и увеличение удельной активности Р450-редуктазы в 1,5 раза, при этом максимальная скорость Vmax и константа Михаэлиса–Ментен Km реакций окисления 7-это- ксикумарина и 7-этоксирезоруфина не отличались от контрольных. Следует отметить повышение у подопытных животных уровня удельного содержания цитохрома Р420 в 3,0 раза по сравнению с контрольным (р<0,05), что может указывать на способность изучаемого препарата дестабилизировать мембраны эндоплазматического ретикулума.

Результаты проведенных in vitro опытов на культурах ЭФЧ и А-549 показали, что ГЭ-АЛК в концентрации 2·10^–3 моль·л^–1 приводит к дегенерации монослоя с отделением клеток от стекла. В концентрации 2·10^–4 моль·л^–1 препарат подавляет пролиферацию клеток ЭФЧ в 2,8 раза, клеток А-549 в 6,3 раза по сравнению с контрольными данными. В опытах с уровнем воздействия 2·10^–5 моль·л^–1 ГЭ-АЛК не наблюдали существенного влияния препарата на пролиферативную активность исследуемых культур: за время опыта количество клеток ЭФЧ увеличилось в 16 раз, а клеток линии А-549 – в 26 раз по сравнению с исходным состоянием до внесения препарата, что соответствует пределам нормального роста данных линий в условиях in vitro . Рассчитанная величина среднеэффективной концентрации цитотоксического действия CL 50 составляет для культуры ЭФЧ 1,14·10^–4 (1,08·10^–4÷1,21·10^–4) моль·л^–1, для культуры А-549 – 0,5·10^–4 (0,48·10^–4÷ ÷0,54·10^–4) моль·л^–1.

В диапазоне реализации цитотоксического действия изучено влияние данного соединения на структурно-функциональные показатели состояния липидного бислоя in vitro при введении флуоресцентного зонда пирена в суспензию теней эритроцитов интактных крыс. Добавление ГЭ-АЛК в концентрациях 2·10^–5, 2·10^–4, 2·10^–3 моль·л^–1 приводило к тушению флуоресценции пирена без изменения коэффициента эксимериза-ции – соотношения между эксимерами F _э при λ _эм 475 нм и мономерами F м при λ эм 373 нм, что свидетельствует о деградации липидного бислоя.

Исследование структурно-функциональных параметров мембран эритроцитов в субхроническом эксперименте in vivo на белых крысах указывает на зависимое от воздействия ГЭ-АЛК в дозе 440 мг/кг снижение микровязкости липидного бислоя и аннулярного (прибелкового) липида, о чем свидетельствует увеличение коэффициентов эксимеризации, при этом показатели их полярности оставались в пределах контрольных значений. Исследование интенсивности безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых ос- татков на пирен выявило достоверное снижение данного показателя на 38 % (р<0,05), что указывает на уменьшение погруженности белковых молекул в липидный бислой.

Хроническое внутрижелудочное введение белым крысам ГЭ-АЛК в дозах 110, 30 и 11 мг/кг в течение 6 месяцев не вызывало клинических проявлений интоксикации и гибели. Со стороны нервной системы при дозе 110 мг/кг наблюдали у подопытных животных снижение двигательной активности и величины СПП на 34 % по отношению к контролю (р <0,05). Воздействие ГЭ-АЛК не приводило к изменению биохимических показателей сыворотки крови, в том числе маркерного параметра субхронического воздействия - уровня общего билирубина. О нарушении состояния мочевыводящей системы свидетельствуют достоверное снижение величины показателя водородных ионов мочи (рН 6,2), снижение суточного диуреза в 4,3 раза и клиренса креатинина в 2,6 раза по отношению к контролю.

При хроническом внутрижелудочном введении белым крысам ГЭ-АЛК в дозе 30 мг/кг обнаружено лишь достоверное снижение СПП на 35 %, что позволило определить данный уровень воздействия в качестве порога хронического действия ( Lim chr ). Таким образом, лимитирующим показателем хронического общетоксического действия ГЭ-АЛК является функциональное состояние нервной системы по изменению СПП.

Проявления токсического действия препарата отсутствовали при дозе 11 мг/кг (максимальная недействующая), что позволило использовать данную величину для расчета допустимой суточной дозы (ДСД) ГЭ-АЛК. Учитывая высококумулятивные свойства соединения, максимальная недействующая доза снижена в 100 раз (коэффициент запаса), что определило величину ДСД на уровне 0,11 мг/кг. Допустимое суточное поступление (ДСП) для человека с учетом ДСД и средней массы 50 кг не должно превышать 5,5 мг/сут (суммарное количество препарата, поступающее из разных сред).

Прогнозные значения ориентировочно безопасного уровня воздействия (ОБУВ) в воздухе рабочей зоны ГЭ-АЛК рассчитывали по формулам, предложенным для всех групп пестицидов [16]. Результаты анализа полученных значений показали, что наиболее низкое расчетное значение гигиенического норматива - 0,8 мг/м3.

ОБУВ ГЭ-АЛК в атмосферном воздухе установлен на уровне 0,01 мг/м3 по расчетам [7], учитывающим молекулярную массу, основные параметры токсичности и величину ОБУВ в воздухе рабочей зоны. При данной величине ОБУВ в организм человека с атмосферным воздухом может поступить 0,2 мг ГЭ-АЛК, что составит 3,6 % от ДСП для человека.

Для прогноза ориентировочно допустимого уровня (ОДУ) в воде применяли уравнения, отражающие корреляционные связи между этой величиной, установленными токсикологическими параметрами (DL50), нормативами в других объектах окружающей среды (воздух рабочей зоны), физическими константами [6]. Минимальное расчетное значение ОДУ ГЭ-АЛК составило 0,1 мг/дм3. Результаты органолептических исследований воды, содержащей ГЭ-АЛК на уровне минимального расчетного значения, показали, что запах при 20 °С и 60 °С отсутствует.

Ориентировочно допустимая концентрация (ОДК) ГЭ-АЛК в почве рассчитана по величине ДСД [15] и составляет 0,3 мг/кг. Агротехническое применение препарата для предпосевной обработки семян ячменя, рапса, льна-долгунца при рекомендуемых нормах расхода до 3 г/т (до 150 мг/га) не приведет к превышению установленного ОДК в почве.

Так как препарат предназначен для применения при возделывании ярового ячменя, озимого рапса и льна-долгунца, то выполнено расчетное обоснование максимальных допустимых уровней остаточных количеств (МДУок) ГЭ-АЛК в зерне хлебных злаков, рапсе (зерно, масло) и льне (масло).

С пищевым рационом в организм человека может поступить до 70 % остаточных количеств средства защиты растений, обнаруживающегося во всех средах. В этом случае расчетное безопасное поступление ГЭ-АЛК с пищевыми продуктами составит 3,85 мг/чел./сут.

При определении МДУок ГЭ-АЛК в зерне хлебных злаков (0,1 мг/кг) и рапса (0,6 мг/кг), масле рапса и льна (0,6 мг/кг) учитывали нормы среднесуточного потребления пищевых продуктов.

Следовательно, возможное суточное поступление ГЭ-АЛК в организм человека с учетом установленных нормативов для различных сред составит: с пищевыми продуктами - 0,11 мг (2 % от ДСП), с водой - 0,3 мг (5,5 % от ДСП), воздухом - 0,2 мг (3,6 % от ДСП), в сумме 11,1 % от ДСП.

Таким образом, по результатам токсикологической оценки обоснован ряд гигиенических регламентов ГЭ-АЛК в среде обитания человека: ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,8 мг/м3, ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/м3, ОДУ в воде водоемов - 0,1 мг/дм3, ОДК в поч- ве – 0,3 мг/кг, ДСД – 0,1 мг/кг, МДУок в зерне хлебных злаков – 0,1 мг/кг, рапс (зерно, масло), лен-долгунец (масло) – 0,6 мг/кг.

Выводы. В результате проведения комплексных токсиколого-гигиенических исследований нового регулятора роста растений ГЭ-АЛК при различных режимах, дозах и путях поступления в организм лабораторных животных установлены параметры его токсикометрии, особенности биологического действия, проявляющиеся кожно-резорбтивными, кумулятивными и раздражающими слизистые оболочки свойствами, умеренной репродуктивной токсичностью без существенных признаков гонадотропного, мутагенного и аллергенного действия на организм. Установлено, что токсическое действие ГЭ-АЛК на организм сопровождается мембранотропными и цитотоксическими эффектами. В хроническом эксперименте определены лимитирующие показатели вредного действия ГЭ-АЛК, на основании которых разработаны допустимая суточная доза для человека и ряд регламентов содержания препарата в объектах окружающей среды (воздух рабочей зоны и атмосферы, вода, почва), продовольственном сырье и пищевых продуктах (зерно хлебных злаков и рапса, рапсовое и льняное масло).

Полученные данные могут рассматриваться как исходные для установления референтных уровней безопасности по критериям допустимого риска для здоровья.