Ответ на неоадъювантную химиотерапию с включением препаратов платины у больной раком молочной железы с делецией гена BRCA1 в опухоли

Ген BRCA1 расположен на длинном плече 17 хромосомы (17q21.31) и кодирует ядерный фосфобелок, который участвует в репарации ДНК в клетке и в регуляции клеточного цикла (PubMed; OMIM 113705). Это первый ген, для которого было определено явное участие в этиологии семейного рака молочной железы (РМЖ) [1]. Герминальная мутация гена BRCA1 также увеличивает риск развития рака шейки и тела матки, поджелудочной железы и толстой кишки [2]. Герминальная мутация BRCA1 5382insC в 20-м экзоне выявлена в 1994 г. и была показана ее сопряженность с высоким риском развития наследственного рака молочной железы и яичников [3]. Это наиболее распространенная мутация гена BRCA1, которая составляет 80 % мутаций в гене BRCA1 и 60 % от общего объема мутаций в генах BRCA1/2 для славянского населения [4]. При этом показано, что больные РМЖ с данной мутацией BRCA1 особенно чувствительны к неоадъювантной химиотерапии (НХТ) с использованием препаратов платины [5, 6]. Это объясняется тем, что продукт гена-супрессора BRCA1 входит в репарационный комплекс, обладающий высокой чувствительностью к повреждению ДНК. При возникновении генетических дефектов в работе белков комплекса нарушается процесс репарации ДНК и мутантные клетки, подвергающиеся действию генотоксических агентов (таких как препараты платины), как правило, погибают [7, 8]. Предполагается, что различные соматические изменения гена BRCA1 в опухоли молочной железы, которые оказывают влияние на его активность и, в частности, на снижение/повышение экспрессии данного гена, аберрации числа копий (copy number aberration – CNA), делеции и дупликации, точко-вые мутации и др., могут играть важную роль в чувствительности опухоли к препаратам платины, что дает возможность для их назначения на предоперационном этапе лечения [9].

Приводим клинический случай персонализированной неоадъювантной химиотерапии у больной РМЖ, при выборе схемы НХТ в качестве предиктивного маркера определяли мутации гена BRCA1 в опухоли.

Проведенная работа соответствует этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ № 266, от 19.06.2003. От лица, участвующего в исследовании, получено информированное согласие.

Больная В., 42 лет. В марте 2017 г. обнаружила уплотнение в левой молочной железе. Обратилась в клиники НИИ онкологии Томского НИМЦ. Выполнена биопсия. Морфологическое исследование (№№ 10602–07/17) показало наличие инвазивной дольковой карциномы. По результатам иммуно-гистохимичекого исследования: ER – 5 баллов, PR – 8 баллов, Her2/neu+++, Ki67 – 54 %, трижды позитивный вариант. Наследственность не отягощена. Проведено обследование на наличие герминальной мутации BRCA1 5382insC; результат отрицательный.

По данным клинического обследования установлен диагноз (С50.5): Рак нижненаружного квадранта левой молочной железы IIA стадии, T2N0M0. На предоперационном этапе лечения принято решение о проведении неоадъювантной химиотерапии. Для персонализированного выбора схемы НХТ выполнено молекулярно-генетическое исследование биопсийного опухолевого материала (~10 мм3), помещенного в консервирующий раствор RNAlater (Sigma Ink).

Из биопсийного опухолевого материала выделяли ДНК и РНК. Выделение ДНК и РНК производилось с помощью набора QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Germany) и Plus RNeasy mini Kit (Qiagen, Germany) соответственно. Концентрацию и чистоту выделения РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) (53,9 нг/мкл, А260/А280=2,09; А260/А230=2,01). Для ДНК концентрация составила 88,4 нг/мкл, А260/А280=1,93; А260/А230=2,09. Целостность РНК и ДНК оценивали при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA). Для РНК RIN составил 7,4; фрагменты ДНК имели массу более 50 kbp.

Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с помощью набора RevertAid™ (Thermo Scientific,

Рис. 1. Результат микроматричного исследования: (А) – хорошо видна делеция 17q21.31; (Б) – результат цифровой ПЦР: представлены графики положительных капель для гена рефери и гена BRCA1 и количество копий/мкл

USA) со случайными гексануклеотидами. Уровень экспрессии гена BRCA1 (PubMed NM_007294.3) оценивали при помощи обратно-транскриптазной количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) с оригинальными праймерами и зондами по технологии TaqMan (Forward primer 5’-acagctgtgtggtgcttctgtg-3’; Reverse primer 5’-cattgtcctctgtccaggcatc-3’; Probe FAM-5’-catcat-tcacccttggcacaggtgt-3’- BHQ1; Amplicon 107 bp) на амплификаторе Rotor-Gene-6000 (Corbett Research, Australia). ПЦР ставился в трех репликах в объеме 15 мкл, содержащем 250 мкM dNTPs (Sibenzyme, Россия), 300 нM прямого и обратного праймеров, 200 нM зонда, 2,5 мM MgCl2, 19 SE buffer (67 мM Tris–HCl pH 8,8 при 25 ºC, 16,6 мM(NH4)2SO4, 0,01 % Tween-20), 2,5 ед HotStart Taq polymerase (Sibenzyme, Россия) и 50 нг кДНК. Двухшаговая программа амплификации включала 1 цикл – 94 ºС, 10 мин – предварительная денатурация; 40 циклов – 1 шаг 94 ºС, 10 сек и 2 шаг 20 сек – при температуре 60 ºС. В качестве гена-рефери использовались два гена-рефери: GAPDH (glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase, PubMed NM_001256799.2) (Forward primer 5’-gccagccgagccacatc-3’; Reverse primer 5’- ggcaacaatatccactttaccaga-3’; Probe FAM-5-’-cgcccaatacgaccaaatccg-3’- BHQ1; Amplicon 124 bp) и ACTB (actin beta, PubMed NM_001101.4) (Forward primer 5’-gagaagatgacccagatcatgtt-3’; Reverse primer 5’-atagcacagcctggatagcaa-3’; Probe FAM-5’-agaccttcaacaccccagccat-3’- BHQ1; Amplicon 73 bp), уровень экспрессии гена BRCA1 нормализовался по отношению к экспрессии генов-рефери и измерялся в условных единицах. Относительная экспрессия оценивалась с помощью метода Pfaffl [10]. В качестве калибратора использовалась пулированная от 20 пациентов РНК, выделенная из морфологически нормальной ткани молочной железы, полученной во время операции от больных, которым не проводилась НХТ.

Для изучения CNA гена BRCA1 в опухоли проводили микроматричный анализ на ДНК-чипах высокой плотности фирмы Affymetrix (USA) CytoScan™ HD Array. В качестве проверки результатов микроматричного исследования была использована цифровая ПЦР (Droplet Digital PCR – Система ddPCR QX200, Bio-Rad, USA) (рис. 1). С использованием программного обеспечения QuantaSoft™ 1.7.4.0917 осуществлялся подсчет капель, дающих флуоресцентные положительные и отрицательные сигналы для расчета концентрации целевой ДНК. CNA в опухолевой ткани определялось по отношению к референсным локусам генома человека (гены SLC22A17 (NM_001289050.1), KPNA1 (NM_002264.3), CASR (NM_000388.3)) по формуле

CNV=(A/B)×NB, где A – концентрация молекул-мишеней; B – концентрация референсных молекул; NB – число копий референсных локусов в геноме.

В результате молекулярно-генетического исследования выявлена делеция гена BRCA1 в опухоли молочной железы. Подтверждением этому явился низкий уровень экспрессии данного гена – 0,686.

Исходя из полученных данных была персона-лизированно назначена схема неоадъювантной химиотерапии CP (циклофосфан, цисплатин). Проведено 6 курсов НХТ (Циклофосфан – 1080 мг / Цисплатин 135 мг). Осложнения неоадъювантной химиотерапии: тошнота/рвота II степени, слабость I степени, печеночная токсичность. При оценке эффект лечения по данным УЗИ – полная морфологическая регрессия. 03.11.2017 проведена операция в объеме секторальной резекции левой молочной железы с аксиллярной лимфаденэктомией и интраоперационной лучевой терапией ложа опухоли в дозе 10 Гр. Гистологическое исследование (№№ 28641–64/17): инвазивный дольковый рак без метастатического поражения 15 лимфоузлов. Границы резекции без опухолевой ткани, лечебный патоморфоз I степени по RCB и IV степени по Лавниковой – полная морфологическая регрессия.

В дальнейшем больной назначена послеоперационная гормонотерапии ингибиторами ароматазы (с учетом состояния менопаузы, данных УЗИ и гормонального фона) в течение 5 лет, таргетная терапия трастузумабом в течение года. Кроме того, проведен курс дистанционной лучевой терапии на оставшуюся часть молочной железы в стандартном режиме в дозе 2 Гр до СОД 46 Гр (с учетом интраоперационной лучевой терапии 10 Гр на ложе удаленной опухоли).

Общий срок наблюдения за больной составил 12 мес. Данных о прогрессирования заболевания не получено.

Заключение

Частота герминальной мутации гена BRCA1 не превышает 10 %, при этом частота делеций данного гена может варьировать от 30 до 45 %, что значительно расширяет возможность применения препаратов платины у пациентов, отрицательных по герминальной мутации, в отношении достижения полной морфологической регрессии и высоких показателей выживаемости. Определение делеции гена BRCA1 в опухоли молочной железы при помощи микроматричного исследования является высокотехнологичным и точным методом, но, к сожалению, дорогостоящим. В качестве хорошей альтернативы может использоваться система цифровой капельной ПЦР, что в значительной степени упростит и удешевит проведение данного молекулярно-генетического анализа.