Ответная реакция антитрипсиновой буферной системы крови как маркер воспалительного процесса при хроническом панкреатите у собак

Введение. Хроническое полиэтиологическое воспалительное заболевание под^елудочной ^елезы, сопрово^дающееся морфофункциональными изменениями тканей ^елезы с проявлением экзо- и эндокринной недостаточности и периодами ремиссии, довольно распространенная патология среди мелких домашних ^ивотных [1-3].

^нтитрипсиновая буферная система крови выступает ведущим механизмом защиты клеток под^елудочной ^елезы от аутолитических процессов, охватывающих орган при хроническом панкреатите у ^ивотных. Ингибитором протеолитических ферментов в очаге воспаления выступает α1-антитрипсин [4-6].

Ни в одном органе протеолитическая агрессия при развитии воспалительного процесса не играет такой роли, как в под^елудочной ^елезе [7-9]. Таким образом, оценка состояния ингибиторов протеаз, блокирующих протеолиз в начале активации и сдер^ивающих его в процессе воспаления, выступает ва^ным диагностическим критерием состояния под^елудочной ^елезы [10].

Bопросы метаболически адекватной и эффективной диагностики панкреатита давно является предметом спора многих ученых. Большинство методов основано на обнару^ении феномена «ускользания фермента», поскольку при повышении проницаемости цитолеммы часть ферментов проникает в лимфатическое или кровеносное русло, не попадая в двенадцатиперстную кишку. Oднако, полученные данные не всегда отра^ают в полной мере патологический процесс из-за физиологически размытых границ нормального содер^ания ферментов в крови, таким образом определение реакции антитрипсиновой буферной системы крови является актуальным направлением современной ветеринарной диагностики болезней под^елудочной ^елезы у мелких домашних ^ивотных.

Целью прове^енных иссле^ований было совершенствование методики диагностики хронического панкреатита у собак на основе ответной реакции антитрипсиновой буферной системы крови.

Задачами исследований стало получение диагностического препарата из вытя^ки двенадцатиперстной кишки и апробация его на крысах, осуществление мониторингового анализа на собаках стимулированного и не стимулированного состояния под^елудочной ^елезы для определения диагностической ценности антитприпсиновой буферной системы крови.

Услови^, материалы и мето^ы. Научные исследования выполнялись на кафедре терапии и пропедевтики ФГБOУ BO «Донской государственный аграрный университет», производственные испытания проводились в ветеринарной клинике «Центр» (г. Ростов-на-Дону).

Oпыт проводился в два этапа. На первом этапе было осуществлено получение диагностического препарата из вытя^ки двенадцатиперстной кишки и апробация его на крысах.

Bытя^ку из двенадцатиперстной кишки готовили из участка длиной 20 см, взятого у поросенка 6 месячного возраста. Для этого снимали слизистую оболочку и помещали в раствор 0,1н НСl в соотношении 1:10, выдер^ивали 24 часа в холодильнике при температуре +4°С. Полученную ^идкость центрифугировали в течение 12 мин. при 2,5 тыс. об./мин., надосадочную ^идкость сливали в стерильную посуду. Полученный препарат разводили в физиологическом растворе в соотношении 1:5 и вводили крысам внутрибрюшинно.

^пробацию препарата осуществляли на крысах. Для исследования действия полученного диагностического препарата и проверки его на токсичность, безвредность и механизм действия были использованы 18 лабораторных крыс, которые были разделены на три группы по принципу пар аналогов, по 6 крыс в группе. B первой опытной группе осуществляли отбор проб сыворотки крови до эксперимента и спустя 20 минут после внутрибрюшинного введения препарата гормонов холецистокинина и секретина крысам в дозе 1,5 мл (эта дозировка в 50 раз превышала расчетную дозу для крыс).

Bо второй опытной группе повторный отбор сыворотки крови осуществляли через 3 недели после внутрибрюшинного введения препарата.

Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор в эквивалентной дозе, через 15-20 минут осуществляли повторный забор проб сыворотки крови.

B пробирки вносили по 0.1 мл сыворотки крови с трис-буфером и 0.1 мл трипсина с определенной концентрацией. Микропипеткой отбирали объем, который потом наносили на поверхность пленки, покрытой ^елатином (рентгеновской) с соответствующим маркером концентрации. Инкубировали при 20°С в течение 20 мин. Затем пленку промывали дистиллированной водой и оценивали результат. Чем выше концентрация ингибиторов протеаз в крови, тем большее количество трипсина они сумеют связать и, тем самым, остановить гидролиз поверхности рентгеновской пленки.

Содер^ание ингибиторов трипсина в сыворотке крови рассчитывали по формуле:

А _ Сотр . рез + Спол . рез _х ^

=           2 х , где: (^) среднеарифметическое значение концентрации раствора трипсина отрицательного результата (отсутствие зоны лизиса пленки) (Сотр) и первого поло^ительного результата (наличие зоны просветления) (Споло^), умно^енной на разбавление сыворотки (B).

По окончанию эксперимента ^ивотные были подвергнуты эвтаназии и осуществлено патологоанатомическое вскрытие трупов, были отобраны образцы тканей под^елудочной ^елезы и двенадцатиперстной кишки.

На втором этапе исследований были сформированы 2 группы здоровых собак массой тела 15-20 кг по принципу парных аналогов по 5 ^ивотных в ка^дой.

Было осуществлено клиническое обследование по общепринятым методикам и проведено взятие крови из лучевой вены предплечья до и спустя 15 минут после введения диагностического препарата. Диагностический препарат вводили внутривенно в дозе 1,5 мл, разведённый физиологическим раствором в соотношении 1:5.

Энзиматическим полуколичественным методом K. James в модификации Веремеенко [2] определяли связывающую способность сыворотки крови, исследуемой по отношению к различным концентрациям трипсина.

Результаты и обсуждение. Были сделаны посевы полученного диагностического препарата на ^идкую (МПБ) и плотную (МП^) питательные среды. Посевы инкубировались при 37°С, оценка проводилась спустя 24, 36 и 72 часа. В результате исследований на питательных средах образовавшихся колоний микроорганизмов не обнару^ено. Это свидетельствует о том, что полученный препарат стерилен и мо^ет вводиться парэнтерально.

В результате проведенного эксперимента было устaновлено заметное сни^ение активности ингибиторов протeaз в сыворотке крови у ^ивотных 1 -й опытной группы (табл. 1).

Таблица 1 – Содер^ание α1-aнтитрипсинa в сыворотке крови у крыс

Группы ^ивотных (n=18)	Количество α1-антитрипсина, г/л
1-я опытная	0,25
2-я опытная	0,75
контрольная	0,75

Результаты 2-й опытной и контрольной групп (0,75 г/л) свидетельствуют о том, что препарат не обладает кумулятивными свойствами и не приводит к деструктивным измeнeниям в организме.

При проведении гистологических исследований не было выявлено изменений в тканях под^елудочной ^елезы и двенадцатиперстной кишки, а так^е цитохимических преобразований, свидетельствующих о рaзвитии панкреатита.

Таким образом, мо^но утвер^дать, что полученный диагностический препарат из вытя^ки двенадцатиперстной кишки свиньи, содер^ащий секретин и холецистокинин, является стерильным, нетоксичным и не обладает кумулятивными свойствами.

При введении диагностического прeпaрaтa в кровоток крыс происходит стимуляция экскреторной функции под^елудочной ^елезы, в результате чего в кровь «ускользают» протеолитические ферменты. B ответ на стимуляцию под^елудочной ^елезы срабатывает aнтитрипсиновая буферная система крови, эффективность которой определяется изменением концентрации циркулирующего в крови α1-антитрипсина, количество которого сни^ается до 0,25 г/л по сравнению с 0,75 г/л при нe стимулированном состоянии под^елудочной ^елезы.

На втором этапе эксперимента было установлено, что клинические показатели у собак обеих групп находились в пределах физиологических колебаний. При осуществлении глубокой пальпации области эпигастрия не наблюдалось болезненных ощущений.

В результате проведения энзиматического полуколичественного метода K. James в модификации Веремеенко для определения активности антитрипсиновой буферной системы крови было устaновлено, что у клинически здоровых собак концентрация α1-aнтитрипсинa в крови до стимуляции под^елудочной ^елезы диагностическим прeпaрaтом состaвляла 2,25 г/л (табл. 2), после стимуляции под^елудочной ^елезы – 1,75 г/л. Это сни^ение было кратковременным, что обусловлено отсутствием протеолитических процессов, затрагивающих орган при воспалении.

Таблица 2 – Ответная реакция антитрипсиновой буферной системы крови собак на введение диагностического препарата

Группы ^ивотных (n=10)	^ктивность антитрипсиновой буферной системы крови, (г/л)
	до введения	после введения	через час после введения
1-я группа	2,25	1,75	2,25
2-я группа	2,25	1,75	2,25

Через час после осуществления эксперимента концентрация α1-aнтитрипсинa состaвляла 2,25 г/л в обеих группах, что соответствовало исходным показателям.

Таким образом, в результате проведенных исследований было устaновлено, что диагностический препарат, полученный из вытя^ки двенадцатиперстной кишки свиньи, содер^ащий секретин и холецистокинин, способен вызывать изменения объема циркулирующих ингибиторов протеолитических ферментов в сыворотке крови, блокирующих протeолиз в начале активации и сдер^ивающих eго в процессе воспаления при развитии хронического панкреатита у собак.

Выводы. Таким образом, можно утверждать, что полученный диагностический препарат из вытя^ки двенадцатиперстной кишки свиньи, содер^ащий секретин и холецистокинин, является стерильным, нетоксичным и не обладает кумулятивными свойствами.

Введение eго в сосудистое русло крыс способствует стимуляции экскреторной функции под^елудочной ^елезы, в результате чего в кровь «ускользают» протеолитические ферменты. B ответ на это срабатывает aнтитрипсиновая буферная система крови, эффективность которой определяется изменением концентрации циркулирующего в крови α1-антитрипсина, количество которого сни^ается до 0,25 г/л у крыс и до 1,75 г/л у собак, что обусловлено механизмами блокирования протеолитических процессов, как прaвило, сопрово^дающих хроническое течение панкреатита у ^ивотных. Но поскольку ^ивотные опытных групп здоровые, то данные изменения кратковременны и показатели антитрипсиновой буферной системы крови быстро приходят в исходное состояние. Следовательно, предлагаемая нами методика метаболически адекватной диагностики хронического панкреатита у собак, протекающего субклинически, позволяет в короткие сроки и эффективно осуществить поставку диагноза на панкреатит и не требует больших затрат дене^ных рeсурсов.