Панкреатическая секреция и усвоение аминокислот в кишечнике кур при разных источниках белка в рационе

В пищеварительном тракте корм превращается в вещества, способные усваиваться организмом, чем в итоге определяются обменные процессы. Задача современной науки состоит в повышении конверсии корма в продукцию животноводства, в том числе за счет физиологических приемов. Прежде всего это связано с эффективным использованием птицей кормового белка, что выдвигает определенные требования к его полноценности, оптимальному соотношению лимитирующих продуктивность аминокислот, их доступности к всасыванию и использованию в метаболических процессах. В последние годы появилось достаточно работ по изучению усвоения аминокислот в процессе пищеварения у свиней (1-3) и птицы (4, 5). Для этого предложены методы, которые позволяют определить кажущуюся и истинную илеальную усвояемость аминокислот. Известно (1), что традиционные способы определения доступности аминокислот в терминальном участке пищеварительного тракта не позволяют получить достоверные показатели из-за существенных качественных и количественных изменений состава азотсодержащих веществ под воздействием микроорганизмов, населяющих толстый кишечник. Поэтому оценка доступности аминокислот по разнице их количества, потребленного с 374

кормом и идентифицированного в непереваренных остатках содержимого терминальной части подвздошной кишки — илеума (ileum), выполняется на илеостомированных животных так называемым илеальным методом. С его помощью показали, что аппетит животных зависит в первую очередь от сбалансированности рационов по незаменимым аминокислотам (6).

Пищеварительные ферменты тонкого кишечника адаптируются к источнику потребляемого белка (7). Ранее мы установили, что секреторная функция поджелудочной железы бройлеров и кур реагирует на баланс аминокислот в рационе, причем при введении лимитирующей аминокислоты до нормы потребности ферментативная активность панкреатического сока значительно усиливается (8, 9). При изучении микробных сообществ была установлена связь их состава с метаболизмом незаменимых аминокислот у кур-несушек (10). Однако нам не известны работы по изучению зависимости между доступностью аминокислот и вкусовыми качествами корма.

В представляемой работе, использовав илеальный метод, мы впервые показали, что усвоение аминокислот в пищеварительном тракте кур зависит от секреторной функции поджелудочной железы, которая адекватно реагирует на качество белкового питания.

Нашей целью было изучение в физиологическом опыте активности ферментов в панкреатическом соке и химусе подвздошной кишки, а также содержания аминокислот в илеуме кур при использовании разных по протеину комбикормов в рационе.

Методика . Секреторную функцию поджелудочной железы исследовали в условиях хронического опыта на двух курах породы леггорн в возрасте 7-8 мес с фистулами, вживленными по методу Ц.Ж. Батоева с соавт. (11). Использовали метод периодов: в течение первых 10 сут птицу кормили контрольным комбикормом (он соответствовал зоотехническим нормам), а последующие 10 сут — комбикормом, содержащим трудногидролизуемые компоненты (отруби пшеничные, подсолнечный жмых). Опыты начинали утром натощак. После первых 30 мин опыта куры получали 30 г комбикорма, после чего в течение 2,5 ч с интервалом 30 мин у них собирали панкреатический сок. В полученных порциях секрета определяли количество сока, активность амилазы, протеаз и липазы.

Ферментативную активность и аминокислотный состав химуса анализировали у трех кур породы леггорн в возрасте 30-40 сут, которым вживили Т-образную канюлю в подвздошную кишку на расстоянии 10-15 см от ее перехода в толстый отдел кишечника. Эксперимент начинали утром натощак, птице давали по 30 г комбикорма и в течение 1 ч собирали химус кишечника. Образец центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин, после чего разбавляли раствором Рингера (1:50).

Активность амилазы оценивали по Смит-Рою-Уголеву (12), выражая как количество расщепленного крахмала (мг) в расчете на 1 мл сока за 1 мин, протеолитических ферментов — по количеству гидролизованного казеина (мг) в расчете на 1 мл сока за 1 мин (показатели измеряли при λ = 670 нм для амилазы и λ = 450 для протеаз на фотометре КФК-3, ОАО «Загорский оптико-механический завод», Россия) (13), активность липазы исследовали на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS3000P («SINNOWA», Китай) с набором ветеринарных диагностических реагентов для определения концентрации липазы в крови животных («ДИАКОН-ВЕТ», Россия).

Количество свободных аминокислот в химусе подвздошной кишки кур определяли с помощью ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией нингидриновым реагентом и последующим детекти- рованием при λ = 570 нм (для пролина λ = 440 нм). Анализы выполняли с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) YL 9100 HPLC System («Young Lin Instrument Co., Ltd», Корея), которая состоит из кватернарного градиентного насоса YL9110, вакуумного дегазатора YL9101, UV/VIS детектора YL9120, автосамплера YL9150 (постколоночный дериватизатор Pinnacle PCX, ионообменная колонка Na+ 4,0½150 мм, 5 мкм, предколонка Na+ 3,0½20 мм, 5 мкм; «Pickering Laboratories, Inc.», США).

Представлены среднее ( Х ) и стандартные ошибки средней ( х ). Достоверность различий оценивали по t -критерию Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при Р ≤ 0,05.

1. Состав комбикормов в эксперименте Результаты . Примененная

методика получения панкреатического сока уникальна вследствие Ингредиент Содержание в комбикорме, % контроль опыт морфологической особенности пи- Пшеница 33,6 44,7 Ячмень 45,1 22,9 щеварения птиц, у которых три Отруби пшеничные Шрот соевый 0 9,4 13,6 0 протока поджелудочной железы и Жмых подсолнечный 4,5 11,3 два желчных протока впадают в Известняк (36 %) 2,3 2,4 Монокальцийфосфат 1,1 0,9 12-перстную кишку в одном ме- Кукурузный глютен 1,0 1,0 сте. При илеостомировании из ки- Рыбная мука Масло подсолнечное 1,0 1,0 1,0 1,0 шечника выкраивается участок Соль поваренная 0,25 0,25 (изолированный мешочек), в ко- Сульфат натрия Бленд: 0,196 0,205 торый переносят главный панкре- минеральный 0,08 % 0,080 0,080 атический проток, концы кишеч- витаминный 0,02 % Метионин 0,020 0,066 0,020 0,091 ника соединяются «конец в ко- На 100 г корма нец» непрерывными швами. Ме- Обменная энергия, ккал Жир сырой, % 270,0 3,57 260,0 4,98 тодика позволяет получать пан- Клетчатка сырая, % 5,0 6,0 креатический сок в период опы- Протеин сырой, % 16,0 14,0 тов, а в остальное время направ- Кальций, % 1,20 1,20 Фосфор, % 0,64 0,70 лять его по внешнему анастомозу в кишечник. После восстанови- тельного периода птицу можно использовать продолжительное время.

Рецептуры комбикорма в опыте и контроле представлены в таблице 1.

Наши эксперименты показали, что внешнесекреторная функция поджелудочной железы кур четко адаптируется к качеству корма (табл. 2), причем это происходило главным образом за счет изменения ферментативной активности, а не количества панкреатического сока.

2. Экзокринная функция поджелудочной железы у кур породы леггорн в зависимости от качества потребляемого комбикорма ( n = 20, Х ± х )

Показатель	1-я к	урица	2-я к	урица
	контроль	опыт	контроль	опыт
Количество панкреатического сока за опыт, мл Активность:	5,4±0,49	6,8±0,50	7,0±0,31	8,8±1,15
амилазы, мг•мл - 1•мин - 1	3400±240,8	3534±187,5	1984±86,1	2800±530,7
липазы, U/l	7792±396,5	9824±498,9*	11515±768,9	13518±74,6*
протеазы, мг•мл - 1•мин - 1	257±18,4	200±14,4*	164±11,4	105±5,3*
Соотношение амилаза:протеаза	13:1	18:1	12:1	27:1
* Различия с контролем статистически значимы при Р ≤ 0,05.

Секреция большего количества ферментов, необходимых для переваривания поступающей пищи (и, как следствие повешение их концентрации в панкреатическом соке), — по-видимому, наиболее совершенный тип специфических ферментных адаптаций поджелудочной железы. При невозможности (по каким-либо причинам) осуществить специфическую адаптацию в организме реализуется менее экономный и менее специфический 376

механизм — увеличивается количества секретируемого сока. Во втором случае количество ферментов может не так строго соответствовать качеству рациона. Наиболее детально изучить механизм адаптации панкреатических ферментов можно, выполнив анализ динамики соко- и ферментовыделе-ния после приема корма (14, 15).

В нашем эксперименте отмечалось изменение активности двух ферментов: липазы и протеаз. Активность липазы у 1-й курицы при введении в рацион опытного комбикорма увеличивалась на 26,1 % (P ≤ 0,05), у 2-й — на 17,4 % (Р ≤ 0,05). Протеолитическая активность, наоборот, уменьшалась при замене комбикорма, содержащего 16 % сырого протеина на комбикорм с 14 % сырого протеина у 1-й особи — на 22,2 %, у 2-й — на 36,0 % по сравнению с контролем. Существенно изменялось и соотношение амилазной и протеазой активности: если в контрольный период оно составляло 12-13:1, то в опытный увеличивалось до 18-27:1. Это свидетельствует об адаптации ферментативной активности к низкопротеиновому рациону.

Таким образом, при замене в рационе более питательного и энергетически сбалансированного корма на низкопротеиновый и с меньшей (на 10 ккал) обменной энергией внешнесекреторная функция поджелудочной железы реагировала снижением активности протеолитических ферментов на 22-36 % и повышением активности липазы на 17-26 % по сравнению с контролем. Это было связано с добавкой трудногидролизуемых компонентов корма — отрубей пшеничных (13,6 %), жмыха подсолнечного (11,3 %), ячменя (22,9 %), а также повышением количества жира на 39,4 % (см. табл. 1). Причем наиболее существенные различия отмечали в первые часы после кормления, что обусловлено сложнорефлекторной фазой регуляции панкреатической секреции и, следовательно, вкусовыми качествами корма (14). С учетом того, что поджелудочная железа — один из центральных органов пищеварительной системы и ее функция коррелирует с переваримостью корма (16), при наблюдаемых изменениях следует ожидать снижение эффективности переваривания белка рациона.

Активность пищеварительных ферментов химуса подвздошной кишки, а основную их часть составляют панкреатические ферменты, адаптировалась к характеру питания (табл. 3).

3. Ферментативная активность химуса подвздошной кишки у кур породы леггорн в зависимости от качества потребляемого комбикорма (среднее для 3 кур, n = 20, Х ± х )

Показатель	Комбикорм		К контролю, %
	контрольный	опытный
Активность амилазы, мг•мл - 1•мин - 1	269±44,1	167±16,4*	62,1
Активность липазы, U/l	2479±293,3	2435±185,8	98,2
Активность протеаз, мг•мл - 1•мин - 1	21,0±1,39	13,8±1,55*	65,7
* Различия с контролем статистически значимы при Р ≤ 0,05.

Наиболее существенные изменения наблюдались в активности амилолитических и протеолитических ферментов при замене комбикорма, содержащего 16,0 % сырого протеина на комбикорм с пониженным содержанием сырого протеина (14,0 %). В этом случае активность амилазы уменьшалась на 37,9 %, протеаз — на 34,3 %. Замена контрольного комбикорма на измененный (см. табл. 1) не влияла на активность липазы, несмотря на то, что количество жира в кормах несколько различалось.

Сопоставление активности панкреатических ферментов в соке поджелудочной железы и дуоденальном химусе позволило сделать заключение о том, что при использовании в рационе птицы контрольного комбикорма активность ферментов при поступлении секрета в кишечник снижалась следующим образом: амилазы и протеаз — в 10 раз, липазы — в 4 раза по сравнению с активностью фермента в панкреатическом соке (рис.). Замена рациона влияла на соотношение ферментов: активность амилазы панкреатического сока при поступлении в дуоденум снижалась в 19 раз, липазы — в 5 раз, протеаз — 11 раз. Причем следует отметить, что активность амилазы в панкреатическом соке кур на фоне комбикорма в опыте увеличилась на 17,5 %, а в кишечном химусе уменьшилась на 37,9 %, что свидетельствует о разбавлении дуоденального химуса другими пищеваритель-

Амилаза Липаза Протеазы

Активности амилазы (мг•мл ^{- 1}•мин ^{- 1}) , липазы (U/l) и протеолитических ферментов (мг•мл ^{- 1}•мин ^{- 1}) в соке поджелудочной железы (а — контроль, в — опыт) и дуоденальном химусе (б — контроль, г — опыт) у кур породы леггорн при использовании в рационе разных по питательности комбикормов. Описание состава кормов в контроле и опыте см. в таблице 1. Приведены средние значения ( n = 20) для 3 кур. Показатели активности липазы уменьшены в 10 раз, протеаз — увеличены в 10 раз.

ными соками, водой и т.д. или об образовании ферментно-субстратного комплекса при расщеплении углеводов. Это можно объяснить, исходя из состава корма в опыте — с содержанием большего (по сравнению с контролем) количества некрахмалистых полисахаридов, препятствующих взаимодействию пищеварительных ферментов, субст- ратов и повышающих вязкость химуса (17, 18).

Активность протеолитических ферментов в панкреатическом соке и дуоденальном химусе изменялись одновременно, уменьшаясь при использовании измененного комбикорма (опыт). Соотношение активности липазы в панкреатическом соке и дуоде- нальном химусе было самым низким (4-5:1), что связано с относительно высокой активностью фермента в кишечнике, поскольку желчь, которая выделяется у кур в кишечник вместе с панкреатическим соком, — наиболее сильный стимулятор и эмульгатор жиров (19).

4. Аминокислотный состав кормов и химуса подвздошной кишки у трех кур породы леггорн в зависимости от качества рациона (усредненные пробы)

Аминокислота	В комбикорме, %		К контролю, %	В химусе, %		К контролю, %
	контроль	опыт		контроль	опыт
Цистеиновая	0	0		0,014	0,011	78,6
Аспарогиновая	1,24	0,88	70,9	0,008	0,029	362,5
Треонин	0,55	0,45	81,8	0,015	0,047	313,3
Серин	0,69	0,60	86,9	0,007	0,026	371,4
Глутаминовая	3,17	3,15	99,4	0,025	0,057	228,0
Пролин	1,18	1,17	99,1	0,015	0,037	246,7
Глицин	0,68	0,66	97,0	0,015	0,036	240,0
Аланин	0,75	0,70	93,3	0,026	0,025	96,1
Цистин	0,30	0,28	93,3	0,011	0,005	45,5
Валин	0,75	0,67	89,3	0,017	0,034	200,0
Метионин	0,42	0,38	90,5	0,009	0,011	122,2
Изолейцин	0,61	0,51	83,6	0,012	0,027	225,0
Лейцин	1,20	1,10	91,7	0,023	0,039	169,6
Тирозин	0,49	0,44	89,8	0,013	0,033	253,8
Фенилаланин	0,77	0,65	84,4	0,017	0,031	182,3
Лизин	0,94	1,06	112,8	0,025	0,032	128,0
Гистидин	0,43	0,34	79,1	0,006	0,016	266,7
Аргинин	0,92	0,73	79,3	0,007	0,021	300,0
Всего	15,10	13,77		0,270	0,520

Изучение аминокислотного состава химуса подвздошной кишки кур (табл. 4) показало, что количество протеина в комбикормах различалось на 1,33 % по исследованным аминокислотам. Только по лизину пока- затели для комбикорма в опыте превышали контрольные (на 12,8 %), а по остальным аминокислотам наблюдалось снижение. Если сравнивать количество основных аминокислот с нормами, рекомендуемыми для яичных кур (20), то можно отметить, что контрольный комбикорм и основная часть корма в опыте этим нормам соответствует. В нашем эксперименте в период потребления комбикорма с трудногидролизуемыми компонентами содержание суммы аминокислот в химусе подвздошной кишки увеличилось по сравнению с контрольным периодом до 3,77 % от количества аминокислот в корме. При скармливании контрольного комбикорма у кур в подвздошной кишке неусвоенными остались 1,79 % содержащихся в нем аминокислот, что почти на 2 % меньше, чем в период опыта. В научной литературе имеются данные о том, что при снижении доли сырого протеина в рационе уменьшается экскреция общего азота, главным образом за счет увеличения илеальной усвояемости аминокислот (21). Однако при использовании протеина из одного источника количество белка не влияет на усвоение аминокислот в подвздошной кишке (22).

В представленной работе мы не ставили цель установить истинную доступность аминокислот, а попытались связать секреторную функцию поджелудочной железы с процессом усвоения аминокислот при разном содержании и качестве белка в рационе для того, чтобы понять причины, которые влияют на доступность аминокислот для птицы. Вопрос об истинной доступности аминокислот остается дискуссионным, что обусловлено трудностями при определении эндогенных аминокислот, в том числе из-за ограничений практически всех существующих методов их определения (2). Однако комплексное изучение процессов пищеварения на фисту-лированных курах, на наш взгляд, позволяет внести ясность и рассматривать процессы расщепления белков и их всасывание с учетом нервногуморальной регуляции. Преимущество этого заложенного академиком И.П. Павловым подхода к изучению физиологии пищеварения в том, что он позволяет рассматривать процессы не фрагментарно (23), а на уровне организма в целом.

Итак, наиболее сбалансированные по составу белковые компоненты корма положительно влияют на секреторную функцию поджелудочной железы, стимулируют аппетит птицы, повышая илеальную усвояемость аминокислот.