Параметры эритропоэза и цитоархитектоника циркулирующих эритроцитов крыс с асцитной опухолью яичников

Введение. Исследование эритроцитов в патогенезе опухолевого роста привлекает внимание потому, что клетки красной крови - носители информации о процессах, протекающих в организме. Рост опухоли может привести к нарушению метаболизма эритроцитов, в результате чего возможно снижение их жизнеспособности и изменение их эластических свойств [1–5]. Накопление в мембранах эритроцитов высокотоксичных метаболитов за счет активации перекисного окисления липидов и аутокаталитического возрастания количества его продуктов способствует ухудшению физических параметров мембран, снижению способности красных клеток крови к деформации в микроциркуляторном русле [6].

Основная роль в регулировании производства эритроцитов в костном мозге принадлежит эритропоэтину. На сегодня известно, что при канцерогенезе отсутствует адекватное увеличение уровня эритропоэтина [7]. Состояние гипоксии выступает как стимулятор синтеза эритропоэтина, но увеличение уровня гормона при канцерогенезе недостаточно для предотвращения анемии. Таким образом, анемия у онкологических больных возникает в результате нарушения гемопоэза [8].

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) -уникальный метод исследования биологических объектов без фиксации. Благодаря большому пространственному разрешению АСМ на сегодняшний день является основным ин- струментом для изучения рельефа биологического объекта. Характерная форма эритроцитов и их относительно небольшая толщина позволяют получить прочный препарат на стекле и изучить стереометрическую характеристику этих форменных элементов [9].

Поскольку эритроциты достаточно быстро изменяют морфофункциональные характеристики при воздействии патологических факторов, очевидно, что изучение состояния их мембран при экспериментальном канцерогенезе может дать ценную информацию о функциональной неполноценности эритроцитов.

Цель исследования. Изучить морфометрические показатели эритроцитов и изменение эритропоэза у животных-опухоленосите-лей при развитии неопластического процесса.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены на белых беспородных крысах массой 180–200 г с перевиваемой асцитной опухолью яичников (АОЯ, штамм РЯ, РОНЦ им. Н.Н. Блохина, г. Москва). Прогрессирование данного типа опухоли проходит в 3 фазы: логарифмическая (с 4-х сут после перевивки), стационарная (с 8-х сут после перевивки), терминальная (с 13-х сут после перевивки). В качестве материала для исследования использовали периферическую кровь экспериментального животного. Забор крови осуществляли в стационарную (n=64) и терминальную (n=64) фазы роста опухоли. Контрольную группу составили здоровые половозрелые крысы (n=62). Гематологические показатели крови оценивали с помощью анализатора Mindray BC 3600. Уровень эритропоэтина оценивали в плазме крови иммуноферментным методом (Mouse/Rat Epo Immunoassay, США). Подсчёт ретикулоцитов производили на 1000 клеток. Оценку осуществляли с помощью светового микроскопа Nikon Eclipse E200. Исследование морфометрических показателей эритроцитов проводили на свежевысушенных мазках крови методом АСМ (Solver Pro, NT-MDT, г. Зеленоград, Россия) в полуконтактном режиме. Использовали фирменные кремниевые зонды с жесткостью 0,2 N/m, радиус закругления кончика зонда составлял 10 нм.

Все животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к воде и корму. Были соблюдены «Правила проведения работ и использования экспериментальных животных», утверждённые Приказом МЗ СССР № 755 от 12 августа 1977 г., положения Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг., а также требования этического комитета ИМЭиФК Ульяновского государственного университета (№ 10 от 15.06.2014).

Результаты и обсуждение. В результате проведенных исследований нами установлено прогрессирующее снижение показателей гематокрита как в стационарную, так в терминальную фазы роста опухоли. Средний объем эритроцита (МСV) на всех сроках роста опухоли статистически значимо не отличался от показателей группы контроля. Показатель среднего содержания гемоглобина в отдельном эритроците (MCH) статистически значимо снижался в стационарную и повышался в терминальную фазу, не достигая однако контрольных значений. Как в стационарную, так и в терминальную фазы отмечалось статистически значимое повышение коэффициента вариации размеров эритроцитов (RDW-CV) и ширины распределения эритроцитов по объему (RDW-SD) относительно контроля, что предполагает возникновение пойкилоцитоза и анизоцитоза (табл. 1).

Данные, представленные в табл. 2, свидетельствуют о статистически значимом повышении высоты эритроцита как в стационарную, так в терминальную фазы роста опухоли, статистически значимом изменении глубины впадины в стационарную фазу роста АОЯ (в терминальную фазу углубление впадины не отмечается). Также установлено достоверное повышение среднего диаметра эритроцита и изменение длины эритроцитов во всех изученных фазах роста экспериментальной неоплазмы. Площадь поверхности эритроцита увеличивалась при прогрессировании опухоли, что соответствует изменению формы от нормоцита к сфероциту.

Таблица 1

Показатели	Контроль, n=62	Стационарная фаза, n=64	Терминальная фаза, n=64
Ht, %	38,1±0,5	34,3±0,5*	31,3±0,3*
MCV, фл	52,8±0,8	53,3±0,7	53,0±0,5
MCH, пг/мл	21,30±2,01	15,8±1,6*	17,2±1,3
MCHС, г/л	401±38	295,7±31,3*	318,5±28,1*
RDW-CV	0,166±0,002*	0,185±0,002*	0,2±0,001*
RDW-SD	32,1±0,2	33,1±0,2*	34±0,2*

Примечание. * - статистически значимые различия с показателями контроля (р<0,05).

Морфофункциональные показатели крови крыс с АОЯ

Таблица 2

Морфометрические параметры эритроцитов у животных-опухоленосителей

Показатели	Контроль, n=62	Стационарная фаза, n=64	Терминальная фаза, n=64
Высота эритроцита, мкм	0,453±0,010	0,505±0,020*	0,364±0,010*
Глубина впадины, мкм	0,374±0,013	0,163±0,020*	Без впадины
Средний диаметр эритроцита, нм	6,03±0,17	6,78±0,12*	7,17±0,14
Длина, нм	7,603±0,118	8,350±0,246*	9,090±0,185*
Площадь, мкм2	45,50±1,42	55,25±3,08*	65,27±3,01*

Примечание. * - статистически значимые различия с показателями контроля (р<0,05).

При сканировании образцов эритроцитов крыс контрольной группы методом АСМ в основном (98 %) обнаруживались нормоциты с типичной дисковидной формой (рис. 1). В стационарную фазу цитоархитектоника эритроцитов менялась. Основную массу (52 %) эритроцитов составляли обратимо деформированные формы (рис. 2). В терминальную фазу роста опухоли 50,8 % эритроцитов представляли собой сфероциты (рис. 3).

Таким образом, в процессе экспериментального канцерогенеза наблюдается рост количества дегенеративных форм.

Для оценки эритропоэза определяли объем эритроцитов, уровень гемоглобина, количество ретикулоцитов и концентрацию эритропоэтина в периферической крови живот-ных-опухоленосителей (табл. 3).

Из представленных данных (табл. 3) следует, что количество эритроцитов в периферической крови как в стационарную, так в терминальную фазы роста АОЯ снижается по сравнению с контролем. Одновременно значимо уменьшается количество гемоглобина, что ведёт к нарушению дыхательной функции крови (табл. 3). Подобные изменения зарегистрированы у больных с колоректальным раком, раком шейки матки и раком легкого [10–12]. В эксперименте у крыс «Вистар» при развитии карциносаркомы также зафиксировано токсическое влияние опухоли на систему кроветворения [13]. В то же время показано снижение количества эритроцитов в циркулирующей крови у животных-опухоле-носителей с АОЯ на 4-е и 8-е сут роста опухоли [14].

Рис. 1. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и 3 D-изображение (в) интактных эритроцитов

б

а

в

а                                    б

Рис. 2. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и 3D-изображение (в) эритроцитов в стационарную фазу

а                                  б                               в

Рис. 3. Топология (а), боковое сечение профиля (б) и 3D-изображение (в) эритроцитов в терминальную фазу

Таблица 3

Показатели эритропоэза в организме-опухоленосителе при развитии АОЯ

Показатели	Контроль, n=62	Стационарная фаза, n=64	Терминальная фаза, n=64
Эритроциты, млн/л	7,20±0,05	6,40±0,08*	6,00±0,04*
Гемоглобин, г/л	156,70±9,66	112,23±7,87*	102,67±7,01*
Ретикулоциты, %	10,5±1,0	11,50±1,31	13,2±1,0*
ЭПО, пкг/мл	23,70±0,34	74,20±8,82*	48,10±6,45*

Примечание. * - статистически значимые различия с показателями контроля (р<0,05).

Регулирование производства эритроцитов в костном мозге осуществляет эритропоэтин. Нами было установлено статистически значимое повышение уровня эритропоэтина в плазме крови, наиболее выраженное в стационарную фазу роста опухоли (табл. 3). Одновременно увеличивается доля ретикулоцитов в крови, что также свидетельствует о стимуляции эритропоэза (табл. 3).

При экспериментальной карциносаркоме у крыс «Вистар» отмечается также повышение концентрации эритропоэтина. Авторы предполагают, что повышение эритропоэтина может являться отражением количественных, а не качественных перестроек механизмов контроля кроветворения при экспериментальном канцерогенезе [13].

Заключение. У крыс с экспериментальной АОЯ в динамике развития неоплазмы на фоне напряжённого эритропоэза снижается количество эритроцитов в периферической крови, количество гемоглобина, а также изменяется их цитоархитектоника, что может свидетельствовать о токсическом влиянии опухоли на систему кроветворения.