Параметры острой токсичности и кожно-раздражающего потенциала кормовой композиции с метапробиотическими свойствами

В условиях интенсивного промышленного животноводства на ограниченных по площади производственных помещениях с высокой плотностью поголовья животных, применение в рационах кормов, содержащих антибиотики, привело к появлению резистентных к средствам данной группы условно-патогенных и патогенных микроорганизмов [1, 2]. С целью получения качественной продукции, прежде всего с точки зрения ее экологической безопасности, с 1 января 2006 г. в животноводстве стран Европейского союза запретили использование стимуляторов роста на основе антибиотиков при выращивании сельскохозяйственных животных [3]. По этой причине во всем мире, включая и Российскую Федерацию, ведутся работы, посвященные разработкам, внедрению нового поколения безопасных и эффективных кормовых добавок, в качестве альтернативы антибиотическим препаратам.

В настоящее время добавки с пробиотическими свойствами широко применяются в кормах для сельскохозяйственных животных, прежде всего свиней и птицы [3, 4]. Согласно определению, которое сформулировано членами группы экспертов ФАО и ВОЗ, «пробиотики» представляют собой «живые активные штаммы различных микроорганизмов, приносящих пользу здоровью организма хозяина при их использовании в необходимых количествах» [4, 5].

В последние несколько лет особое внимание начали привлекать метапробиотические добавки, которые состоят из различных активных штаммов и их метаболитов, и обладают комплексным действием [6]. Так, в научнопроизводственной компании «БИОТРОФ» разработана добавка под названием «Пробиоцид-Ультра» - комбинация штаммов бацилл и органических кислот (фумаровая и лимонная) микробного происхождения, способных ингибировать развитие условно-патогенных и патогенных бактерий, стимулировать рост и метаболическую активность кишечной нормофлоры цыплят-бройлеров [6]. В настоящее время Всероссийским научноисследовательским институтом фитопатологии (ФГБНУ ВНИИФ) создан опытный образец метапробиотического препарата для птицеводства. Добавка содержит в себе штаммы L. acidophilus

IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активные метаболиты (антибиотики, экзополисахариды), обладающие антимикробными свойствами в отношении возбудителей кишечных инфекций и микотоксикозов цыплят-бройлеров, а также внеклеточные ферменты (целлюлазы, ксиланазы, амилазы, пектиназы, фитазы, протеазы и липазы) с различной субстратной специфичностью, способных к гидролизу различающихся по составу компонентов кормов сельскохозяйственных птиц.

Одним из основных требований, которые предъявляются к разрабатываемым кормовым добавкам, является доклинические исследования их безопасности [7, 8]. Общепринятым считается разделение токсикологических исследований на оценку общетоксических свойств и установление специфических видов токсичности.

Цель исследований – оценка параметров острой токсичности и кожнораздражающих свойств кормовой композиции на основе L. acidophilus IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активных метаболитов.

Материал методы исследований. В работе применяли изготовленный ФГБНУ ВНИИФ опытный образец кормовой добавки, который состоит из пробиотических штаммов бактерий L. acidophilus IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активных метаболитов.

Все процедуры с лабораторными животными, включая условия содержания и кормления, осуществляли по общепринятым этическим нормам обращения с животными, которые приняты Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, применяемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) и Международным рекомендациям Европейской Конвенции по защите используемых для экспериментальных исследований животных (1997), а также требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г.

Перед началом исследований прошедшие карантин лабораторные животные распределяли на группы, формирование которых проводили в соответствии с принципом аналогов, учитывая их возраст, живую массу и пол. Отклонение от среднего значения параметра массы тела в одной группе животных составляло не более 10%. Наблюдение за физиологическим состоянием, поведением и сохранностью животных в период карантина осуществляли ежедневно.

Класс острой токсичности опытного образца кормовой добавки с метапробиотическими свойствами устанавливали в соответствии с основополагающим документом OECD Test № 423 «Острая пероральная токсичность – метод определения класса острой токсичности» («Acute Oral Toxicity -Acute Toxic Class Method», 2001), позволяющей осуществить классификацию исследуемого препарата и определить его опасность по классификационной системе GHS [9].

Экспериментальное исследование проводили на белых мышах линии BALB/c, массой от 19 до 21 г обоего пола, в количестве 20 особей. Животные разделяли на две равные группы:

Контрольная группа – животные, которым вводили основу исследуемой кормовой композиции (n = 10).

Опытная группа – животные, которым вводили образец кормовой добавки, содержащей бактериальные штаммы с суммарным титром (1,0±0,3)*109 КОЕ/мл и их биологически активные метаболиты (n = 10).

При оценке острой токсичности тестируемый образец кормовой добавки вводили крысам однократно интрагастрально (атравматическим металлическим зондом) в вышеуказанных дозах. Объем вводимых образцов рассчитывали индивидуально с учетом массы каждого животного – 0,1 мл на 10 г живого веса.

После введения исследуемой кормовой композиции за животными устанавливали наблюдение для определения смертности и токсического действия: в 1-ые сутки в течение 12 часов, затем ежедневно 2 раза в день (утром и вечером) - клинический осмотр. В процессе экспериментального исследования оценивали физиологическое состояние организма животных – изменение состояния шерстного (волосяного) покрова, слизистых оболочек, подвижности, реакции на тактильные, болевые и звуковые раздражители, потребление воды и корма, интенсивность роста; определяли негативное воздействие на неврологический статус, включая наличие тремора (дрожания), судорожного расстройства, изменение подвижности и двигательной активности, признаков стереотипного поведения; заболеваемость и сохранность. По окончании экспериментального исследования (на 15 сутки) животных контрольной и опытной групп подвергали эвтаназии и проводили патологоанатомическое их вскрытие для макроскопического анализа внутренних органов.

Оценку раздражающего потенциала опытного образца кормовой добавки с метапробиотическими свойствами проводили способом накожных аппликаций [10]. Экспериментальное исследование осуществляли на беспородных морских свинках, массой тела от 380 до 400 г, в количестве 20 особей. Лабораторные животные разделяли на две равные группы:

Контрольная группа – животным, которым наносили основу исследуемой кормовой композиции (n = 10).

Опытная группа – животные, которым наносили тестируемый образец кормовой добавки, содержащей пробиотические штаммы с суммарным титром (1,0±0,3) ⋅ 109 КОЕ/мл и их биологически активные метаболиты (n = 10).

Однократную и многократные аппликации (20 повторности) изучаемой композиции проводили на предварительно эпилированные и обезжиренные участки кожи боковой поверхности туловища (площадь 4 см2) животных по 5 раз в неделю на протяжении 14 суток. Реакцию кожи на воздействие исследуемой композиции судили визуальным ее осмотром и оценивали в баллах по шкале оценки кожных проб. Определение наличия отека осуществляли количественным методом - измерением толщины складок кожи в мм с применением микрометра. Изучение кожно-раздражающих свойств кормовой добавки также проводили путем ежедневного наблюдения за клиническим состоянием подопытных животных в период эксперимента.

Результат исследований.

Исследование острой токсичности кормовой композиции, содержащей штаммы L. acidophilus IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активные метаболиты, показало, что однократное внутрижелудочное ее применение не вызывает гибели белых мышей линии BALB/c в течение экспериментального периода (Таблица 1).

Таблица 1 – Результаты гибели мышей линии BALB/c после введения опытного образца кормовой добавки интрагастрально

Показатель	Количество животных в группе	Количество погибших животных, гол.
		самцы		самки
		1 сутки	14 сутки	1 сутки	14 сутки
Контрольная группа	10	0	0	0	0
Опытная группа	10	0	0	0	0

Изменения поведенческих реакций и основные параметры жизнедеятельности животных опытной группы находились в пределах физиологической нормы и не отличались от контрольных значений.

Патологоанатомический анализ внутренних органов мышей контрольной и опытной групп показал отсутствие видимых морфологических изменений на поверхности их легких, сердца, почек, селезенки, печени, желудка и кишечника, а также различий их анатомического рисунка на 15 сутки после введения кормовой композиции в исследуемой дозе (Рисунок 1).

Рисунок 1 – Определение состояния внутренних органов мышей линии BALB/c: 1 – контрольная группа животных, 2 – группа животных после интрагастрального введения метапробиотической композиции

Экспериментальное исследование раздражающего эффекта разрабатываемой кормовой добавки на лабораторных животных показало, что композиция, содержащая пробиотические штаммы и их метаболиты, при однократном и многократном нанесении на кожные покровы морских свинок не приводила к возникновению эритемы или отеков (Рисунок 2).

Рисунок 2 – Состояние кожных покровов беспородных морских свинок: 1 – контрольная группа животных, 2 – группа животных после нанесения метапробиотической композиции

На протяжении всего периода эксперимента за подопытными морскими свинками видимых патологических изменений, таких как инфильтрация, изъязвления (некроз), геморрагия в области воздействия выявлено не было. Не было установлено и изменение местной температуры животных. Суммарный балл на появление реакции кожи в соответствии со шкалой оценки кожных проб составил 0 баллов, что указывает на отсутствие опасности сенсибилизации организма животных (Таблица 2).

Статистически значимых различий в толщине кожной складки при аппликации проб в контрольной и опытной группах животных в течение наблюдения не установлено (результаты не показаны).

После накожного нанесения морским свинкам изучаемой кормовой композиции поведенческие реакции и основные параметры их жизнедеятельности находились в пределах физиологической нормы и не отличались от контрольных значений. По массе тела животных достоверных отклонений не выявлено. Выстриженные участки кожи боковой поверхности туловища опытных животных быстро зарастали молодой шерстью и не отличались по густоте с контрольной группой.

Таблица 2 – Результаты раздражающего потенциала опытного образца кормовой добавки при аппликации на кожные покровы беспородных морских свинок

Группа	Количество животных в группе	Оценка в баллах		Раздражающий эффект
		самцы	самки	самцы	самки
Контрольная группа	10	0	0	Отсутствует	Отсутствует
Опытная группа	10	0	0	Отсутствует	Отсутствует

Заключение. Оценка параметров острой токсичности и раздражающего действия композиции на основе L. acidophilus IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активных метаболитов показала, что кормовая добавка не обладает острой токсичностью при пероральном введении теплокровным животным, сенсибилизирующими свойствами при накожной аппликации. По результатам экспериментальных исследований разрабатываемая кормовая добавка с метапробиотическими свойствами отнесена к малоопасным средствам.

Работа выполнена за счет финансовых средств, выделенных в рамках государственной поддержки Всероссийского научноисследовательского института фитопатологии для повышения его конкурентоспособности среди научных центров Российской Федерации и зарубежья, а также поддержки гранта Президента РФ № МК-2439.2022.5 (соглашение № 075-15-2022-414 от «12» мая 2022 г).

Резюме

В данной статье приведены результаты оценки параметров острой токсичности и кожно-раздражающего потенциала композиции на основе пробиотических штаммов       L.

acidophilus IV138, P. acidilactici PA-12, B. subtilis GA24 и их биологически активных метаболитов на теплокровных животных. Установлено, что изучаемая композиция не обладает острой токсичностью при пероральном введении белым мышам линии BALB/c, сенсибилизирующими свойствами при накожной аппликации беспородным морским свинкам. По результатам экспериментальных исследований разрабатываемая кормовая добавка с метапробиотическими свойствами отнесена к малоопасным средствам.