Патогенетическая и клиническая значимость грибкового поражения ладонного апоневроза при контрактуре Дюпюитрена

Болезнь Дюпюитрена (ладонный фасциальный фиброматоз – ЛФФ) относится к фибропролиферативным заболеваниям соединительной ткани, которое характеризуется повышенным содержанием миофибробластов, гиперпродукцией коллагена III и I типов, утолщением и контракцией ладоннопальцевой фасции и дермы кожи [1]. Изменения фасциальных структур и покровных тканей приводят к ограничениям разгибания пальцев, а затем – к контрактурам и фиксированной деформации пястно-фалангового и межфаланговых суставов, снижению силы кистевого схвата [2]. Эти изменения неизбежно снижают качество жизни пациентов, нарушая профессиональные навыки, повседневную активность и социальные контакты [3]. Несмотря на разработку множества методик консервативного, хирургического и миниинвазивного лечения контрактуры Дюпюитрена [4], фасциальный фиброматоз считается инкурабельным, поскольку обладает инфильтративным ростом и рецидивирует [5].

Среди общепринятых теорий этиологии и патогенеза болезни Дюпюитрена основными являются генетическая, микротравматическая, иммунологическая, токсическая, ишемическая [6], метаболическая [7]. Для фиброматозных узлов характерны микрососудистые изменения, прежде всего, окклюзия капилляров и пролиферация перицитов, а также присутствие макрофагов, численность которых коррелирует с количеством миофибробластов; вокруг узлов локализуются лимфоциты [8].

Несмотря на выявление клеток воспалительного ряда у большинства пациентов, роль инфекционных факторов в развитии фасциального фиброматоза традиционно не рассматривается. Однако описан случай флегмонозно-абсцедирующей инфекции при первой стадии заболевания [9], развитие микозов кожи упоминается при контрактурах тяжёлой степени [10]. Втяжения кожи, формирующиеся у некоторых пациентов на ранних стадиях заболевания [11], могут способствовать проникновению возбудителя инфекции вглубь [12]. С помощью сканирующей электронной микроскопии у пациентов с контрактурой Дюпюитрена было установлено наличие почкующейся грибковой флоры в иссечённых при фасциэктомии участках патологически изменённого апоневроза [13]. Диагностика микозов критична не только для полноценной послеоперационной реабилитации, но и дальнейшей жизни пациентов, однако остаётся неясной патогенетическая и клиническая значимость микотической инвазии фасциальных структур кисти.

Цель работы – оценить патогенетическую и клиническую значимость грибкового поражения ладонной фасции при контрактуре Дюпюитрена.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

За период 2017–2020 гг. в Национальном медицинском исследовательском центре травматологии и ортопедии им. акад. Г.А. Илизарова прооперировано 153 пациента с контрактурой Дюпюитрена. Методом случайного отбора сформирована выборка из 41 пациента с контрактурой II-IV степеней по R. Tubiana [14], перенесших частичную фасциэктомию. Среди них было 39 мужчин и 2 женщины в возрасте от 39 до 77 лет.

Критерии включения – клинически выраженный и гистологически подтверждённый ладонный фасциальный фиброматоз. Критерии невключения – контрактуры кисти другой этиологии.

Для гистологического исследования тканевые образцы после фиксации в 10 % растворе нейтрального формалина заключали в парафин по стандартной методике. На микротоме НМ 450 Thermo Scientific (США) изготавливали парафиновые срезы (толщиной 5-7 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином, для выявления мицелия грибов использовали окраску метенамином-серебром P.A.S.M. Светооптическое исследование и оцифровку изображений гистологических срезов осуществляли с помощью микроскопа AxioScope.A1 с цифровой камерой AxioCam и программного обеспечения Zen Вlue Еdition (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия).

Фиксированные в формалине тканевые образцы (размером 3 × 5 мм) для исследования в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) JSM-840 (Jeol, Япония) промывали в дистиллированной воде, затем обезвоживали в этаноле (от 70 до 96 %) и пропитывали 3,3-диметил-2-метиленбицикло[2,2,1]гептаном (камфен) [15]. Образцы высушивали в термостате при 37 °С, затем с помощью токопроводящего клея монтировали на отполированные чистые алюминиевые диски и напыляли серебром в ионном напы-лителе IB-6 (Eiko, Япония). С помощью проводящей пасты обеспечивали отведение заряда с напыленной поверхности образца.

Для последующего клинико-статистического анализа по результатам исследования операционного материала на светооптическом уровне и СЭМ пациенты были подразделены на две группы: контрактура Дюпюитрена без признаков микотической инвазии (группа 1, n = 21) и контрактура Дюпюитрена с признаками микотического поражения ладонного апоневроза (группа 2, n = 20). Для сравнительного анализа использовали следующие параметры: возраст в момент начала ЛФФ, соотношение мужчин и женщин, возраст на момент операции, частота ЛФФ обеих кистей, степень контрактуры, число пальцев с нарушенной функцией, частота первичных операций и операций по поводу рецидивов, частота обращений по поводу рецидивов.

Статистическую обработку количественных данных провели в программе Attestat (версия 9.3.1, разработчик И.П. Гайдышев, сертификат Роспатента № 2002611109). Гипотезы о нормальности распределения проверяли по критериям Шапиро – Уилка. Для некоторых выборок гипотеза о нормальности была отклонена, табличные данные представлены в виде медиан и квартилей, а также минимальных и максимальных значений (Me (Q1÷Q3)) (min-max). Для проверки гипотез о различиях сравниваемых групп применяли критерий Манна – Уитни и точный критерий Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При световой микроскопии парафиновых срезов у четырех пациентов из 41 (9,76 %) были выявлены признаки микотического поражения ладонного апоневроза. Псевдомицеллярные структуры (почкующиеся дрожжевые клетки и псевдогифы) располагались в очагах хронического воспаления с признаками активации лимфоцитов и макрофагов, а также отложениями аморфного эозинофильного вещества (рис. 1, а, б). Окраска P.A.S.M. выявляла серебро-позитивные дрожжевые клетки и псевдогифы в периваскулярных пространствах и в просветах кровеносных сосудов (рис. 1, в, г). У одного пациента из четырёх в очагах хронического воспаления наряду с лимфоцитами и макрофагами обнаружены гигантские многоядерные макрофаги типа клеток инородных тел, дегенеративно изменённые эозинофилы (рис. 1, д).

Рис. 1. Фрагменты ладонного апоневроза при контрактуре Дюпюитрена с признаками грибковой инвазии: а – псевдомицеллярные структуры (стрелка); б – очаг хронического воспаления (стрелка); в, г – псевдогифы в просвете кровеносных сосудов (стрелки); д – гигантские многоядерные макрофаги типа клеток инородных тел (стрелки); е – облитерированная артериола. Парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином (а, б, д, е), метенамин-серебром P.A.S.M. (в, г). Увеличение 200× (а, б) и 400× (в, г, д, е)

Малочисленные дрожжевые клетки и короткие псевдогифы, а также кристаллические включения располагались в цитоплазме гигантских многоядерных макрофагов типа клеток инородных тел. Встречались облитерированные артериолы (рис. 1, е), в которых наряду с погибающими клетками сосудистой стенки и клетками воспалительного ряда выявлялись дегенерирующие дрожжевые клетки.

Методом СЭМ присутствие грибковой флоры (рис. 2, а-г) обнаружено у 20 пациентов из 41 (43,9 %). У 18 пациентов из 20 были выявлены почкующиеся дрожжевые клетки и псевдогифы (рис. 2, а, б, в), а у двух пациентов – псевдогифы с бластоспорами (рис. 2, г).

Дрожжевые клетки имели округлую, округло-овальную, грушевидную либо слегка вытянутую форму, их размеры варьировали от 2 до 7 мкм. Наряду с отдельно лежащими дрожжевыми клетками встречались почкующиеся. У части клеток отмечено ярко контрастированное углубление в центре (рис. 2, в).

Рис. 2. Фрагменты патологически измененного ладонного апоневроза. СЭМ: а – одиночные и почкующиеся дрожжевые клетки; б – псевдогифа; в – псевдогифа и бластоспоры; г – дрожжевые клетки (горизонтальные стрелки), формирующие бластоспоры (вертикальные стрелки). ×2300 (а), ×1700 (б), ×6000 (в), ×1800 (г)

Как при сохранных, так и разрушенных межклеточных контактах на одном конце клетки был выражен кольцевидный поясок, а на другом – почка. Толщина зоны межклеточных контактов составляла не более 0,5 мкм. Бластоспоры расположены на поверхности дрожжевых клеток в виде гроздеподобных скоплений, местами погруженные в межклеточный матрикс (рис. 2, г), имели шарообразную форму, гете-рогенны по размеру. Вокруг почкующихся дрожжевых клеток формировались полости, так как волокна соединительной ткани разрыхлялись, расслаивались и лизировались (рис. 2, а-в).

При сравнении клинико-статистических показателей пациентов (табл. 1), разделённых на группы по признаку отсутствия грибковой флоры или её наличия, установлено, что группы сопоставимы по возрасту, гендерному составу, давности фасциального фиброматоза и частоте поражения обеих рук, степени контрактуры, количеству пальцев с нарушенной функцией, соотношению первичных операций и операций по поводу рецидивов, а также частоте обращений по поводу отдалённых рецидивов (через 11-18 лет после первичной операции) – p > 0,05.

Таблица 1

Клинико-статистические показатели пациентов с контрактурой Дюпюитрена (КД)

Параметры	Группа 1, n = 21		Группа 2, n = 20		P 1,2
	Me (Q1÷Q3)	(min-max)	Me (Q1÷Q3)	(min-max)
Возраст в момент начала ЛФФ, лет	51 (40÷55)	(39-66)	48 (42÷59)	(38-69)	0,921
Мужчины : женщины	21:1		19:1		0,742
Возраст в момент операции, лет	57 (54,5÷63,5)	(45-71)	59 (55÷65)	(39-77)	0,571
Давность фасциального фиброматоза, лет	5 (3÷7,5)	(1-15)	6 (2,25÷10)	(1,5-18)	0,671
Частота фасциального фиброматоза обеих рук, %	57,14		50,0		0,762
Степень контрактуры	3 (2,75÷3)	(1-4)	3 (2,5÷3,75)	(2-4)	0,521
Число пальцев с нарушенной функцией	2 (1÷3)	(1-6)	2 (1÷3,5)	(1-7)	0,991
Соотношение исследованного материала от первичных операций и операций по поводу рецидива	19:2		16:4		0,412
Частота рецидивов контрактуры в отдалённые сроки (11-18 лет), %	9,52		5,00		0,522
Частота ранних рецидивов (4-15 месяцев после первичной операции), %	0		25		0,022*

¹ – критерий Манна – Уитни; ² – точный критерий Фишера; * – различия значимы при p < 0,05

Однако обращений по поводу ранних рецидивов (через 4-15 месяцев после первичной операции) в группе 1 не было, а в группе 2 их частота составила 25 % ( p < 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ

Инвазивные грибковые инфекции вплоть до настоящего времени остаются недооценённой причиной заболеваний и смертности [16] даже у иммунокомпетентных носителей [17].

Наличие грибковой флоры в операционном материале пациентов с контрактурой Дюпюитрена было установлено нами ранее, показана более высокая разрешающая способность СЭМ по сравнению со световой микроскопией в обнаружении грибов и определении их таксономической принадлежности [13]. Данное исследование, выполненное на большем материале, не только подтвердило трудность обнаружения грибковой флоры на светооптическом уровне и частую встречаемость грибковой флоры в ладонном апоневрозе при контрактуре Дюпюитрена, но позволило выявить различные варианты тканевой реакции на внедрение грибов в ладонный апоневроз, а также проникновение дрожжевых клеток и псевдогиф в сосуды, перфорирующих ладонный апоневроз. Проникновению грибковой флоры сквозь эпителиальный и эндотелиальный барьеры могут способствовать нарушения кровоснабжения [18, 19].

Формирующийся в зоне инвазии лимфоцитарно-гистиоцитарный хронический воспалительный инфильтрат, гигантские многоядерные клетки, дегенерирующие эозинофилы, формирование кристаллов и повреждения кровеносных сосудов характерны, но неспецифичны для грибковых инфекций, так как могут встречаться при бактериальных и паразитарных поражениях [20].

Псевдогифы, диморфизм (дрожжевые клетки и бластоспоры), а также особенности ультраструктуры межклеточных контактов грибковых клеток [21] характерны для Candida albicans – наиболее распространённого представителя оппортунистической грибковой флоры, различные стадии морфогенеза которого по-разному влияют на иммунное распознавание [22]. Кандидоз кожи, вызванный другими видами рода Candida, в клинике встречается редко, так как для человека необычен [23]. Поскольку другие виды рода Candida могут отличаться повышенной резистентностью к лекарственным препаратам, в последние годы ведётся интенсивная разработка молекулярных и генетических методов видовой идентификации, которые обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с традиционными микробиологическими методами [24].

Роль гистологического исследования в диагностике микозов велика, так как наличие грибов, а также признаков их инвазии в ткани и кровеносные сосуды в гистологических препаратах является достоверным доказательством глубокой грибковой инфекции [25]. При подозрениях на наличие грибковой флоры и даже при клинической манифестации микозов микробиологические методы часто дают ложно-отрицательные результаты и не позволяют отдифференцировать контаминацию, колонизацию и инфекцию, а методы полимеразной цепной реакции (PCR) и иммуногистохимические реакции доступны не во всех лабораториях, поэтому сканирующая электронная микроскопия оценивается как важный метод диагностики [26], с помощью которого можно выявить грибковые поражения [27].

В работе впервые проведён сравнительный клинико-статистический анализ двух групп пациентов с контрактурой Дюпюитрена: без признаков грибковой инвазии и с поражением ладонного апоневроза грибами рода Candida. Группы сопоставимы по клинико-демографическим характеристикам, но достоверно отличаются по частоте ранних рецидивов контрактуры Дюпюитрена, что свидетельствует о патогенетически значимой роли грибковой инвазии как повреждающего фактора, инициирующего активность фасциального фиброматоза. Характерные для болезни Дюпюитрена иммуногенетиче-ские особенности [28] формируют общие (системные) факторы риска грибковой инвазии. Вовлечение в фиброматозный процесс кожи [29] нарушает её барьерные свойства и создаёт местные условия для внедрения возбудителей инфекции в глубже лежащие ткани. С другой стороны, прежде всего при исследовании Candida albicans, а затем и других видов этого рода грибов разными авторами выявлен пептидный токсин кандидализин, перфорирующий клеточные мембраны и угнетающий систему комплемента [30].

Грибы Candida известны как представители нормальной микробиоты слизистых оболочек и кожи большинства здоровых людей, однако под влиянием общих и местных факторов комменсалы трансформируются в патогены. Для кожного кандидоза характерна поверхностная локализация, поражения дермы и подкожной клетчатки встречаются редко [31]. В выполненном нами исследовании выявлено внедрение псевдогиф Candida в глубокие ткани (ладонный апоневроз), а также в кровеносное русло, что относится к критериям инвазивного кандидоза, который, как правило, развивается вследствие повышенной колонизации в сочетании с нарушенными факторами общей и местной защиты организма пациента [32]. Грибы Candida, проникшие в кровеносное русло, могут быть успешно элиминированы из организма здорового человека, однако у пожилых пациентов с хроническими заболеваниями кандидемия часто приводит к гематогенной диссеминации возбудителя и фатальным осложнениям [33].

Ограничения выполненного исследования – его моноцентровой характер и средний объём выборки.

Перспективны дальнейшие комплексные исследования с применением иммуногистохимического анализа, PCR, микробиологических посевов крови и раневой жидкости для разработки рациональной антимикотической терапии и противорецидивной терапии фасциального фиброматоза. Консультация пациентов с контрактурой Дюпюитрена инфекционистом-микологом и назначение этиотропной терапии не отменяет необходимости коррекции модифицируемых факторов риска кандидоза, к которым относится мальнутриция и дефицит микронутриентов, ожирение, сахарный диабет, нерациональные антибиотикотерапия и приём кортикостероидов [34].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Гистологическое выявление псевдогиф рода Candida в ладонном апоневрозе и просветах кровеносных сосудов у пациентов с контрактурой Дюпюитрена верифицирует инвазивный кандидоз, статистически доказана взаимосвязь грибкового поражения апоневроза с увеличением частоты ранних рецидивов контрактуры. Для увеличения длительности безрецидивного периода и, потенциально, продолжительности жизни пациентов необходимы консультации инфекционистов-микологов и коррекция модифицируемых факторов риска кандидоза.