Патогенетические механизмы развития доброкачественных заболеваний молочных желез при гиперплазии эндометрия в репродуктивном возрасте

Введение. Единство эволюционного развития молочных желез и формирования способности к полноценному внутриутробному вынашиванию потомства, несомненно, определяется связью между молочными железами и женскими половыми органами [1]. Результаты многочисленных исследований доказывают, что пролиферативные изменения в молочных железах очень часто возникают на фоне гинекологических заболеваний [2]. Если в популяции доброкачественная дисплазия молочных желез (ДДМЖ) встречается у 30–70 % женщин, то на фоне гинекологических заболеваний показатель возрастает до 76–97,8 %. Эти факты указывают не только на взаимообусловленность гиперпластических процессов эндометрия и молочных желез, приводящих к преждевременной утрате репродуктивной функции, увеличению числа оперативных вмешательств, но и на необходи- мость пристального внимания к данному контингенту в связи с повышенным риском ма-лигнизации.

У женщин репродуктивного возраста гиперплазия эндометрия (ГЭ) занимает лидирующие позиции в структуре гинекологических заболеваний, составляя 30–50 % [3]. Частота и сроки онкотрансформации ГЭ достаточно вариабельны: от 25 до 50 %, по данным одних авторов, и до 80 % – по данным других [4]. Такой разброс связан с различиями в возрасте больных, особенностями строения эндометриальных желез и выраженностью патологического процесса в эндометрии. Результаты профилактических обследований указывают на наличие доброкачественных заболеваний у 60 % женщин до 40 лет, а в возрастной группе 41–50 лет отмечается увеличение числа нераковых заболеваний молочных желез до 85,7 % [5, 6].

По данным The Cochrane Collaboration, рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре злокачественных новообразований среди женского населения, а рак эндометрия (РЭ) является вторым по распространенности онкологическим заболеванием среди женщин до 65 лет и характеризуется большей заболеваемостью в развитых, нежели в развивающихся, странах [7].

Интересен и дискутабелен вопрос о вкладе рецидивов в ежегодно регистрируемую заболеваемость, что формирует проблему внутри проблемы. Если сам факт частоты рецидивиро-вания сомнений не вызывает, то единого мнения относительно причин возникновения рецидивов доброкачественных заболеваний молочных желез до сих пор нет.

Тенденция к неуклонному росту гиперпластических процессов органов репродуктивной системы, как и низкая эффективность методов диагностики этих нозологий на ранних стадиях развития, актуализируют необходимость расширения представлений об эпидемиологии и этиологии пролиферативных процессов в матке и молочных железах с учетом молекулярно-биологических открытий последнего десятилетия.

Патогенетические механизмы развития пролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы не однозначны: еще с

90-х гг. прошлого века ведущую роль в развитии гиперпластических процессов отводят повышенной концентрации эстрогенов – абсолютной [4, 8, 9] или относительной гиперэст-рогении [1, 10], нарушению баланса гидроксиметаболитов эстрогенов [11, 12], но в то же время у пациенток с нормальным, двухфазным менструальным циклом и гормональным профилем в пределах референсных значений выявляют гиперпластические заболевания матки и молочных желез. Разнообразие результатов, вероятно, объясняется тем, что решающее значение в возникновении заболеваний молочных желез и эндометрия имеет не абсолютная концентрация гормонов в крови, а состояние рецепторов к половым стероидам в ткани [13, 14].

Исследования последних лет связывают развитие пролиферативных заболеваний матки и молочных желез с нарушением процессов апоптоза, точнее, с изменением его генетической регуляции на уровне интегринов – клеточных молекул, играющих ключевую роль в адгезии, инвазии и метастазировании эндометриоидных клеток и формировании миоматозных узлов. До настоящего времени остается неясным, почему при прочих равных условиях у одних женщин с гиперпластическими процессами эндометрия развиваются заболевания молочных желез, а у других – нет.

Несмотря на имеющиеся сведения о генетической детерминированности гиперпластических процессов женского репродуктивного тракта, их малочисленность и противоречивость в отношении участия генов в генезе этих заболеваний не позволяют сформировать комплексного представления об этой проблеме. Между тем есть основание полагать, что выявление генетических предикторов ДДМЖ и ГЭ позволит использовать их в качестве прогностических тестов не только на ранних стадиях развития заболеваний, но и на доклиническом этапе.

Остается открытым вопрос об изменении структуры и свойств эстрогеновых (ER) и прогестероновых (PR) рецепторов, связанных с наличием полиморфизмов кодирующих их генов ( ESR1 и PRG ) [15, 16]. Опубликованы единичные исследования, подтверждающие взаимосвязь аллельного полиморфизма ESR1

с развитием гормонозависимых опухолей эндометрия и молочной железы, а также с эпигенетическими нарушениями [17].

Новым направлением научного поиска стало изучение роли микроРНК в патогенезе ДДМЖ при ГЭ в репродуктивном возрасте. Известно, что микроРНК участвуют во многих клеточных процессах, действуя на специфические гены-мишени [6]. С одной стороны, они служат онкогенами и способствуют процессу опухолевого генеза [18-20], с другой - функционируют в качестве опухолевых супрессоров и подавляют прогрессирование рака [21].

Таким образом, в настоящее время назрела необходимость углубления и расширения спектра исследований, посвященных поиску информативных молекулярно-генетических предикторов формирования ДДМЖ при гиперплазии, создания адекватных комплексных подходов прогнозирования их развития и рецидивирования.

Цель исследования. Определить прогностическую значимость эпигенетических маркеров в патогенезе доброкачественной дисплазии молочных желез при гиперплазии эндометрия в репродуктивном возрасте.

Материалы и методы. Нами обследовано 69 женщин в возрасте 18-49 лет. Критериями включения и стратификации пациенток по группам являлись результаты УЗИ молочных желез, маммография и морфологическая диагностика ГЭ; критериями исключения -наличие острых воспалительных заболеваний органов малого таза, беременности, декомпенсированных тяжелых соматических болезней, злокачественных образований в анамнезе, отказ от участия в исследовании. Были сформированы две группы: I - 27 женщин с гиперплазией эндометрия без атипии, II - 42 пациентки с доброкачественной дисплазией молочных желез при гиперплазии эндометрия без атипии.

Всем пациенткам проводилось молекулярно-генетическое исследование. Изучался полиморфизм гена ESR1 эстрогеновых рецепторов и гена PRG прогестероновых рецепторов, а также соотношение их изоформ в сыворотке крови. Анализ полиморфизмов генов ESR1 и PRG проведён методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией с помощью TagMan-зондов.

Методом ПЦР в режиме real time произведено выделение miR-125b, -155, -222, -429. В качестве референсного гена использовали малую РНК U6. Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР проводили 2(-AACt)-методом.

При помощи непараметрического критерия Краскелла - Уоллиса группы оценивали по количественной шкале. Для определения достоверности различий непараметрических количественных данных был использован критерий Манна - Уитни. Достоверными считались различия при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Все обследуемые женщины находились в возрасте от 18 до 49 лет (в среднем 41,7±6,3 года). У пациенток с ГЭ средний возраст составлял 42,6±5,1 года, что обусловлено преобладанием их в возрастной группе от 41 до 45 лет. Возраст женщин с ДДМЖ при ГЭ колебался от 39 до 43 лет и составлял в среднем 40,8±7,1 года, что не противоречило литературным данным о частоте встречаемости ГЭ в различные возрастные периоды [9]. Все обследованные пациентки были сопоставимы по социальному статусу, ростовесовым показателям, возрасту начала половой жизни, методам контрацепции, на-следствен-ным заболеваниям. Средний возраст менархе у женщин с ГЭ составлял 10,9±0,8 года, в то время как с ДДМЖ при ГЭ - 14,4±1,2 года (р=0,001). В обследованных группах не обнаружены статистически значимые различия по количеству родов, но выявлены по количеству инструментальных (р=0,037) и самопроизвольных абортов (р=0,046). Что касается сопутствующих экстрагенитальных заболеваний, то болезни сердечно-сосудистой системы (ССС) встречались у каждой третей пациентки с ДДМЖ при ГЭ (28,6 %), что достоверно отличалось от другой группы (р=0,010). Анемией страдала каждая шестая пациентка с ДДМЖ при ГЭ (16,7 %), тогда как в другой группе она не обнаружилась (р=0,025). Заболевания щитовидной железы (ЩЖ) были у каждой седьмой женщины с ГЭ (14,8 %), а в группе с ДДМЖ при ГЭ - у каждой второй (40,5 %) (р=0,024), что согласуется с данными литературы [13].

Сравнительная оценка гинекологических заболеваний показала следующие результаты. Миома матки наблюдалась у каждой второй пациентки с ГЭ (44,4 %) и у каждой четвертой с ДДМЖ при ГЭ (21,4 %). Эндометриоз матки встречался у всех женщин в группе ГЭ (100 %) и у каждой второй с ДДМЖ при ГЭ (64,3 %). У каждой второй пациентки с ГЭ (40,7 %) определялась миома матки в сочетании с эндометриозом, а в группе с ДДМЖ при ГЭ - у каждой восьмой (11,9 %). Воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) диагностировались у каждой второй женщины с ГЭ (40,7 %) и у одной пациентки с ДДМЖ и ГЭ (2,4 %). Доброкачественные заболевания шейки матки установили у 74,1 % женщины с

ГЭ и 66,7% пациенток с ДДМЖ при ГЭ. Выявлены статистически значимые различия между группами по частоте встречаемости миомы матки (p=0,043), эндометриоза матки (p=0,0004), их сочетания (p=0,006) и ВЗОМТ (p=0,0001).

Анализ показал, что выявленные экстра-генитальные (заболевания ССС, щитовидной железы, анемия) и гинекологические (ВЗОМТ, аденомиоз, миома матки и сочетание миомы матки с аденомиозом) заболевания являются факторами риска развития ДДМЖ при ГЭ (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Факторы риска развития ДДМЖ у женщин с ГЭ

Risk factors for benign mammary displasia developing in women with endometrial hyperplasia

Фактор риска Risk factor	ОШ OR	95 % ДИ 95 % CI	p
ВЗОМТ PID	7,73	3,27-18,28	0,0001
Аденомиоз Adenomyosis	3,34	1,51-7,27	0,0018
Миома матки Uterine fibroid	1,87	1,25-6,22	0,0287
Миома матки в сочетании с аденомиозом Uterine fibroid combined with adenomyosis	8,34	2,76-25,16	0,0269
Заболевания сердечно-сосудистой системы Cardiovascular diseases	2,82	0,76-10,50	0,0022
Анемия Anemia	2,82	0,76-10,50	0,0023
Заболевания щитовидной железы Thyroid disorders	3,68	1,01-13,36	0,0038

С целью выявления эпигенетических маркеров прогнозирования ДДМЖ при ГЭ была изучена частота встречаемости полиморфизмов гена ESR1, наличие которых может приводить к нарушению чувствительности эстрогеновых рецепторов (ERa) или к ее полной потере. Сравнительный анализ частоты поли- морфизма PvuII C/T гена ESR1 показал, что частота встречаемости аллелей СС у женщин с ГЭ составила 7,7 %, а в группе с ДДМЖ при ГЭ - 26,8 % (р=0,054) (рис. 1). По частоте встречаемости аллелей ТТ и ТС в сравниваемых группах статистически значимых различий не выявлено.

о4 30

Рис. 1. Частота встречаемости полиморфизма PvuII C/T гена ESR1 в сравниваемых группах

Fig. 1. Frequency of PvuII C/T polymorphism in ESR1 gene in the compared groups

Сравнительный анализ частоты полиморфизма XbaI A/G гена ESR1, представляющего собой однонуклеотидную замену аденина на гуанин (A351G) в интронной области гена, демонстрирует, что частота встречаемости алле- лей GG у женщин с ГЭ составила 14,8 %, а в группе с ДДМЖ при ГЭ – 7,1 % (р=0,054) (рис. 2). По частоте встречаемости аллелей АА и AG в сравниваемых группах статистически значимых различий не выявлено.

о4 30

ESR1, Xbal A/G

51,9

7,1

ДДМЖ при ГЕ –BMD with EH

ГЭ – EH

■ AA ■ AG □ GG

Рис. 2. Частота встречаемости полиморфизма Xbal A/G гена ESR1 в сравниваемых группах

Fig. 2. Frequency of Xbal A/G polymorphism in ESR1 gene in the compared groups

Таким образом, в отноении полиморфизма PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора в сравниваемых группах были выявлены статистически значимые различия по частоте встречаемости аллелей СС, а в отношении полиморфизма Xbal A/G гена ESR1 – аллелей GG. В исследовании определялись полиморфизмы Val660Leu и + 331 G/A гена PRG, но статистически значимых различий по частоте встречаемости аллелей полиморфизмов между группами выявлено не было.

Согласно данным литературы [6, 22–24], в настоящее время микроРНК регулируют от 30 до 60 % генов человека, включая гены эстрогеновых и прогестероновых рецепторов. Каждая из них способна контролировать мно- жество (до нескольких сотен) генов, при этом один конкретный ген может являться мишенью для нескольких микроРНК. В частности, miR-125b является потенциальным супрессором опухоли. Снижение уровня экспрессии miR-125b приводит к антиапоптотическому эффекту, усилению пролиферативного потенциала, метастазирования и инвазивности через изменения экспрессии генов в опухолевых клетках. При изучении экспрессии miR-125b в плазме крови у обследуемых женщин установ- лено, что у пациенток с ГЭ ее уровень составил -26,3±30,8, а в группе с ДДМЖ при ГЭ – -70,5±165,8 (р=0,014) (рис. 3). Таким образом, miR-125b является значимым классификатором при дифференциации злокачественных и доброкачественных опухолей молочной железы.

Оценка уровня циркулирующих в крови miR-155 позволяет дискриминировать больных с метастазирующими опухолями от здоровых.

miR-125b

Рис. 3. Результаты сравнительной оценки экспрессии miR-125b в плазме крови женщин

Fig. 3. Results of comparative evaluation of miR-125b expression in blood plasma in women

Рис. 4. Результаты сравнительной оценки экспрессии miR-155 в плазме крови женщин

Fig. 4. Results of comparative evaluation of miR-155 expression in blood plasma in women

Анализ данных (рис. 4) свидетельствует, что экспрессия miR-155 в плазме крови у пациенток с ГЭ составила -17,1±22,9, а в группе с ДДМЖ при ГЭ – -205,6±498,9 (р=0,0001). Таким образом, высокий уровень экспрессии miR-155 является фактором плохого прогноза для больных РМЖ.

К онкогенным относится miR-222, индуцирующий ангиогенез и пролиферацию раковых клеток [22, 25].

Рис. 5. Результаты сравнительной оценки экспрессии miR-222 в плазме крови женщин

Fig. 5. Results of comparative evaluation of miR-222 expression in blood plasma in women

Показано, что повышенная экспрессия клетками опухоли miR-222 приводит к подавлению регуляции механизмов супрессии опухоли [18]. Представленные на рис. 5 данные экспрессии miR-222 в плазме крови у обследуемых женщин свидетельствуют, что экспрессия miR-222 в плазме крови у пациенток с ГЭ составила -22,2±29,2, а в группе с ДДМЖ при ГЭ - -58,9±119,9 (р=0,035).

Согласно литературным данным [18], уровень опухольсупрессирующей miR-429 при раке молочной железы снижен. Из представленных на рис. 6 данных следует, что экспрессия miR-429 в плазме крови у пациенток с ГЭ составила -108,5±84,8, а в группе с

ДДМЖ при ГЭ - -281,3±931,3 (р=0,044).

Нами изучена взаимосвязь miR с полиморфизмом Pvull C/T и Xbal A/G гена ESR1 эстрогеновых рецепторов, Val660Leu и +333G/A прогестероновых рецепторов. При изучении взаимосвязи miR-125b с полиморфизмом PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора самые высокие показатели ТТ (-80,7), ТС (-95,0) и СС (-36,5) выявлены у женщин с ДДМЖ при ГЭ (рис. 7А). При изучении взаимосвязи miR-125b с полиморфизмом Xbal A/G гена ESR1 показатели АА (-69,9) и AG (-91,1) были самыми высокими у женщин с ДДМЖ при ГЭ, в то время как GG (-51,4) - при ГЭ (рис. 7Б).

Рис. 6. Результаты сравнительной оценки экспрессии miR-429 в плазме крови женщин Fig. 6. Results of comparative evaluation of miR-429 expression in blood plasma in women

Рис. 7. Взаимосвязь miR-125b с полиморфизмами PvuII C/T и Xbal A/G гена ESR1 эстрогенового рецептора

Fig. 7. Correlation of miR-125b and PvuII C/T and Xbal A/G polymorphisms in ESR1 gene estrogen receptor

При изучении взаимосвязи miR-155 с полиморфизмом PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора установлено, что самыми высокими показатели ТТ (-242,7), ТС (-319,3) и СС (-57,1) были у женщин с ДДМЖ при ГЭ (рис. 8А). Аналогичная ситуация наблюдалась и при изучении взаимосвязи miR-155 и полиморфизма XbaI A/G. Показатели АА, АG и GG у женщин с ДДМЖ при ГЭ составили: -270,5; -233,5; -60,4, при изолированной форме ГЭ: -10,0; -17,8; -49,6 соответственно (рис. 8Б).

Рис. 8. Взаимосвязь miR-155 с полиморфизмами PvuII C/T и XbaI A/G гена ESR1 эстрогенового рецептора

Fig. 8. Correlation of miR-155 with PvuII C/T and Xbal A/G polymorphisms in ESR1 gene estrogen receptor

При изучении взаимосвязи miR-222 с полиморфизмом PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора установлено, что самыми высокими были показатели ТТ, ТС и СС у женщин с ДДМЖ при ГЭ: -43,5; -88,0; -44,1 соответственно, тогда как при изолированной форме ГЭ они составляли -10,9; -34,6 и -8,5 соответственно (рис. 9А). Что касается полиморфизма Xbal A/G, то показатели АА (-40,8) и АG (-95,1) были самыми высокими у женщин с ДДМЖ при ГЭ, в то время как GG (-54,5) – при изолированной ГЭ (рис. 9Б).

-150

-50

-100

TT       TC       CC

ESR1, PvuII C/T

■ Группа ГЭ

Group HE

■ Группа ДДМЖ и ГЭ

Group BBD with HE Б B

■ Группа ГЭ

Group HE

■ Группа ДДМЖ и ГЭ

Group BBD with HE

А A

Рис. 9. Взаимосвязь miR-122 с полиморфизмами PvuII C/T и XbaI A/G гена ESR1 эстрогенового рецептора

Fig. 9. Correlation of miR-122 and PvuII C/T and Xbal A/G polymorphisms in ESR1 gene estrogen receptor

При анализе взаимосвязи miR-429 с полиморфизмом PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора выявлено, что ТТ (-317,9) был самым высоким у женщин при сочетании ДДМЖ с ГЭ, в то время как ТС (-222,06) – при изолированной форме ГЭ (рис. 10А). Показатель СС был самым высоким у женщин с ДДМЖ при ГЭ и отсутствовал при изолированной форме ГЭ.

Взаимосвязь miR-429 с полиморфизмом XbaI A/G гена ESR1 эстрогенового рецептора показана на рис. 10Б. Из представленных данных следует, что наиболее выраженные изменения АА, AG, GG выявлены у женщин при сочетании ДДМЖ и ГЭ.

Заключение. Выявленные экстрагениталь-ные (заболевания ССС, щитовидной железы, анемия) и гинекологические (ВЗОМТ, аденомиоз, миома матки и сочетание миомы матки с аденомиозом) заболевания являются клинически значимыми факторами риска развития ДДМЖ при ГЭ в репродуктивном возрасте.

В результате исследования получены новые данные о значении эпигенетических факторов в генезе различных форм ДДМЖ у женщин репродуктивного возраста с ГЭ. Впервые определена роль изменений полиморфизма генов ESR1 и PRG рецепторов в развитии ДДМЖ у женщин репродуктивного возраста с ГЭ. В основе патогенеза развития ДДМЖ при ГЭ лежит преобладание аллеля CC полиморфизма PvuII C/T гена ESR1 эстрогенового рецептора, что приводит к снижению чувствительности ERa.

ESR1, PvuII C/T

■ Группа ГЭ

Group HE

• ■    Группа ДДМЖ и ГЭ

Group BBD with HE А A

• ■    Группа ГЭ

Group HE

• ■    Группа ДДМЖ и ГЭ

Group BBD with HE Б B

Рис. 10. Взаимосвязь miR-429 с полиморфизмами PvuII C/T и XbaI A/G гена ESR1 эстрогенового рецептора

Fig. 10. Correlation of miR-429 and PvuII C/T and Xbal A/G polymorphisms in ESR1 gene estrogen receptor

Эпигенетические изменения на уровне микроРНК при ДДМЖ у женщин с ГЭ свидетельствуют о нарушении равновесия «апоптоз – пролиферация», особенно в молочной железе. Высокая экспрессия miR-155, miR-222 и miR-429 свидетельствует о снижении адаптивных свойств клеток, увеличении их пролиферативной активности, индукции ангиогенеза. Высокая экспрессия miR-155, miR-222 и miR-429 является фактором плохого прогноза для больных раком молочной железы.

При изучении взаимосвязи miR-155, -222 и -429 с полиморфизмом гена ESR1 самые высокие показатели Pvull C/T (ТТ, ТС и СС) и Xbal A/G (АА, АG и GG) выявлены у женщин с ДДМЖ при ГЭ в репродуктивном возрасте.

На основании полученных молекулярногенетических исследований дано научное обоснование возможности прогнозирования возникновения и развития пролиферативных заболеваний молочных желез при гиперпластических процессах в эндометрии.