Патоморфологическая оценка эффективности внутрисуставного применения растворимых факторов тромбоцитов для лечения экспериментального остеоартрита

В последние десятилетия ортобиологический подход, как один из принципов регенеративной медицины, приобретает все больший интерес среди специалистов, разрабатывающих технологию получения новых или оптимизированных биологических материалов для локального лечения ОА, и среди ортопедов-травматологов при стабилизации дегенеративных изменений суставного хряща [1-3]. При этом интерес вызывает использование производных крови, включающих аутологичную кондиционированную сыворотку крови (СК) или плазму, обогащенную тромбоцитами (ПОРФТ/PRP) [4-12].

Литературные данные по доклинической оценке эффективности PRP-терапии на биологических моделях ОА достаточно неоднозначны. Наиболее вероятно, это связано с различными способами моделирования ОА, технологиями получения экспериментальных PRP-продуктов, а также кратностью их внутрисуставного введения и интервалами между инъекциями [13, 14, 15].

Во многих исследованиях индуцирование экспериментального ОА осуществляется путем внутрисуставного введения монойодацетата или суспензии талька, однако воздействие химических веществ на гиалиновый хрящ сустава, по нашему мнению, вызывает достаточно распространенное его химическое повреждение, что может сказываться на результатах оценки результатов терапии [15, 16]. Поэтому в нашем исследовании использован оригинальный малотравматичный функциональный способ моделирования ОА коленного сустава у крыс, который воспроизводил основные патогенетические механизмы развития ОА [14, 17].

Кратность введения экспериментальных PRP-продуктов варьирует у различных авторов от одной до трех внутрисуставных инъекций. Патоморфологическая и иммунологическая оценка эффективности PRP-терапии зависит от увеличения толщины суставного хряща, улучшения показателей тинкто-риальных свойств матрикса суставного хряща, появления фиброзно-гиалинового хряща до анальгетического противовоспалительного эффекта [18-24].

Основная цель нехирургического лечения ОА – это стабилизация дегенеративно-воспалительных процессов в суставе, что будет способствовать продлению сроков работоспособности сустава и отдалению сроков выполнения тотальной артропластики. В Республиканском научно-практическом центре трансфузиологии и медицинских биотехнологий (Республика Беларусь, Минск) разработаны оригинальные технологии получения биологически стандартизированных аутологичных и донорской ПОРФТ/PRP.

Для оптимизации малоинвазивного интраартикулярного введения препаратов производных крови мы проводили оценку эффективности их применения при моделировании ОА у экспериментальных животных.

Цель работы – патоморфологически обосновать доклиническую эффективность применения разработанного ПОРФТ/PRP при ОА на основе сравнительного анализа с истощенной плазмой и СК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные

В эксперименте участвовали 120 крыс (60 самок и 60 самцов) линии Wistar. Животные содержались в виварии Гомельского государственного медицинского университета в клетках по три особи, с контролем влажности и температуры. Воду и пищу предоставляли ad libitum. Цикл день/ночь составлял 12 часов. Перед проведением экспериментов животные акклиматизировались в течение 14 дней. Содержание и уход за животными проводили согласно рекомендациям Надлежащей лабораторной практики Министерства здравоохранения Республики Беларусь (ТПК 125-2008 (02040)). При выведении животных из эксперимента соблюдали требования биоэтики Хельсинской декларации гуманного обращения с лабораторными животными в редакции 2013 года [18]. Экспериментальные исследования с животными одобрены комитетом по этике Гомельского государственного медицинского университета (протокол заседания комитета № 4 от 23.12.2020).

При проведении экспериментальных исследований животные были рандомизированы с использованием конвертов/генератора случайных чисел и разделены на четыре равные группы (по 30 животных каждая). В группу 1 (группу исследования) включены крысы, получавшие аллогенную плазму, обогащенную растворимыми факторами тромбоцитов (ПОРФТ/PRP), в группу 2 (группа сравнения 1) – крысы, которым вводили плазму крови крыс, в группу 3 (группа сравнения 2) – сыворотку крови крыс, группа 4 (группа контроля) являлась контрольной.

Приготовление плазмы, сыворотки, ПОРФТ/PRP

Протокол получения ПОРФТ/PRP включал несколько строго определенных стадий. Отбор крови осуществляли шприцом кардиально у крыс под общим наркозом 2,5 % тиопентала натрия, введенного внутрибрюшинно в дозе 45 мг/кг веса. Данный способ позволяет взять примерно 10 мл крови. Со- держимое шприца переносили в пробирки с 3,8 % цитратом натрия (в соотношении 9:1) и центрифугировали при комнатной температуре при 1000 об/мин. в течение 20 мин. С помощью пастеровской пипетки отбирали плазму и лейкотромбоцитарный слой и центрифугировали при 1500 об/мин. в течение 20 мин. Образовавшийся верхний слой отбирали и использовали в качестве плазмы, освобожденной от элементов крови, – обедненная плазма. Контроль содержания тромбоцитов как в обедненном, так и в обогащённом слое проводили на гематологическом анализаторе Sysmex XP-300 (Sysmex Europe GmbH, Германия). Нижний слой, обогащённый тромбоцитами, доводили обедненной плазмой до концентрации тромбоцитов 2,0 × 1012/мл. Для оценки чистоты ПОРФT/PRP проводили подсчет лейкоцитов, число которых было меньше 0,1 × 103/мкл. Полученные фракции плазмы подвергали замораживанию при -70 °C. Через 1-3 дня обогащенную плазму размораживали и центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 15 мин. Супернатант отбирали, фильтровали с помощью стерильных фильтров с диаметром пор 0,2 мкм, расфасовывали по 0,25 мл в пробирки Эппендорф и хранили при 70 °C до использования [19].

Получение сыворотки проводили по общепринятой методике. Полученную кровь в объеме от 5 до 10 мл отстаивали при температуре 4 °C в течение часа. Свернувшуюся кровь центрифугировали в течение 20 мин. при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость – сыворотку без признаков гемолиза – переносили в пробирки типа Эппендорф и хранили при -70 °C до использования.

Хирургическое моделирование остеоартрита и протокол дозирования

Моделирование остеоартрита коленного сустава у крыс проводили по оригинальной методике [25]. Оно включало несколько этапов: рассекали кожу и фасции коленного сустава крысы под ингаляционным наркозом в асептических условиях, затем в полость сустава вводили стерильную инъекционную иглу и механически наносили травму хрящевым структурам наружных мыщелков бедренных и большеберцовых костей режущей частью среза иглы. При этом диаметр иглы соответствовал суммарной толщине хрящевого слоя суставных поверхностей, на рассеченные ткани накладывали швы. Со второго дня послеоперационного периода крыс заставляли ходить в колесе, что создавало статодинамическую нагрузку на травмированные суставы и воспроизводило основные патогенетические механизмы развития остеоартрита. Через две недели после моделирования ОА под ингаляционным наркозом после рассечения кожи под визуальным контролем в коленные суставы животных группы 1 производили введение 0,05 мл ПОРФТ/PRP, группы 2 – 0,05 мл плазмы, группы 3 – 0,05 мл сыворотки крови. Крысам контрольной группы вводили такой же объём физиологического раствора. Инъекции проводили троекратно с промежутками в две недели. Животных выводили из эксперимента по 10 особей через две недели после каждой инъекции. Основные этапы эксперимента представлены на рисунке 1.

1 день 2 недели 4 недели 6 недель

	_____ Группа 1__ * (п=30) f -	0,05 мл ___ ПОРФТ	,0,05 мл , 0,05 мл     _	(n=W)
			ПОРФТ     ПОРФТ    *
			1            1
	Группа 2	0,05 мл __►	(п=10)       (п=10) 0,05 мл ___0,05 мл ___►
	* (п=30)	плазмы	плазмы     плазмы
—	_ Группа 3	0,05 мл __*	1           1 (п=10)      (п=10) 0,05 мл ___0,05 мл ___	(n=W)
	* (п=30)	сыворотки	сыворотки сыворотки
	е±^> , Контроль	0,05 мл ___	(n=W)       (п=10) 0,05 мл ___, 0,05 мл ___	(n=10)
	* (п=30)	0,9% NaCI	” 0,9% NaCI      0,9% NaCI
	1.			(n=W)

(п=10)       (п=10)

Рис. 1. Схема эксперимента с терапией индуцированного остеоартрита коленного сустава у крыс

Приготовление гистологических препаратов

Сразу после вывода животного из эксперимента производили выделение сустава и помещение его в декальцинирующую жидкость Histodecalc (Sigma, Италия) на 48-72 ч. После этого сустав разрезали в сагиттальном направлении, все кусочки тканей фиксировали в 10 % нейтральном забуференном по Лилли формалине в течение 24-48 часов. Гистологическую проводку производили по методике в гистопроцессоре STP-120 (ThermoScientific, Германия), после чего ткани заливали в парафиновые блоки. Из парафиновых блоков на микротоме ThermoScientificMicrom HM 450 (ThermoScientific, Германия) готовили серии срезов толщиной 4 мкм. После депарафинирования проводили окрашивание сафранином O согласно R. Asjid et al. [21].

Морфометрический анализ

Микроскопию и морфометрический анализ проводили с использованием светового микроскопа NikonEclipse 50i (Nikon, Япония). Морфометрическую оценку гиалинового хряща вокруг места его повреждения проводили в трех неперекрывающихся полях зрения. Для оценки патологоанатомических изменений хряща коленного сустава использовали модифицированную F.M.D. Henson et al. балльную шкалу MANKIN [21] (табл. 1).

Таблица 1 Модифицированная шкала MANKIN

Структура	Клеточность	Целостность матрикса	Целостность пограничной линии	Баллы
Гладкая поверхность / норма	Нормальное расположение	Нормальное окрашивание	Нормальная и не нарушена	0
Шероховатая поверхность / одиночная трещина или область расслоения хряща	Кластеры клеток в поверхностном слое или потеря до 10 % клеток	Слабая потеря окраски	Нарушена	1
Множественные трещины / умеренное расслоение хряща	Дезорганизация или потеря до 25 % клеток	Умеренная потеря окраски		2
Фрагментация или сильное расслоение хряща	Ряды клеток отсутствуют или потеря клеток составляет до 50 %	Выраженная потеря окраски		3
Утрата фрагментов хряща	Единичные клетки	Отсутствие окраски		4
Эрозирование не доходит до пограничной линии				5
Эрозирование глубже пограничной линии				6

Статистическая обработка полученных результатов

При проведении анализа Шапиро – Уилка не было выявлено нормального распределения, в связи с чем, все значения показателей в нашем исследовании были представлены медианой, 25-м и 75-м процентилями. Межгрупповые сравнения проводили с использованием теста Краскела – Уоллиса. При проведении теста post-hoc использовали критерий Данна. Статистически значимыми считали результаты при р < 0,05. Для статистического анализа и графического представления данных использовали пакет программ GraphPadPrism v. 7.04 (GraphPadSoftware inc., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Все животные хорошо перенесли хирургические манипуляции на коленных суставах, проводимые под наркозом, и оставались живыми до вывода из эксперимента. Через две недели после первого введения у животных всех групп определяли гистологические признаки выраженного остеоартрита. Отмечали разрушение гиалинового хряща с утратой его фрагментов, определяли участки потери клеток и окрашивания, пограничная линия имела участки прерывистости. Медиана по MANKIN в группе 1 составила 10,50 (9,0; 11,0) баллов, в группе 2 – 11,0 (9,0; 12,3) баллов, в группе 3 – 10,5 (9,8; 11,6) баллов. В контрольной группе медиана баллов была 12,0 (10,8; 13,0). При сравнении групп не определялись ( p = 0,326) статистически значимые различия (рис. 2, а).

Через четыре недели после первой инъекции препаратов производных крови при микроскопии гистологических препаратов гиалиновых хрящей суставов животных группы 1 отмечали участки растрескивания и фрагментации хряща, определяли участки увеличения клональности хондроцитов, имелись области потери окраски и разрывы пограничной линии. В группе 2 у животных наблюдали участки разрушения и потери фрагментов хряща, потерю его клеточности и окраски на единичных участках. У крыс группы 3 имелись участки потери фрагментов хряща, на месте которых определяли незрелую соединительную ткань, пограничная линия была прерывиста. У животных группы контро- ля отмечали образование незрелой соединительной ткани на месте дефекта хряща, потерю клеточ-ности и прерывистость пограничной линии. Медиана баллов по MANKIN через четыре недели эксперимента у животных группы 1 составила 3,00 (3,0; 4,3) балла, в группе 2 – 4,0 (3,0; 5,3) балла, в группе 3 – 7,0 (6,8; 8,0) баллов. В контрольной группе крыс медиана баллов по MANKIN была 8,0 (7,0; 9,0). При сравнении групп определяли (p < 0,001) статистически значимые различия. Межгрупповые различия представлены на рисунке 2, б.

б

а

MANKIN (баллы)

в

Рис. 2. Патоморфологическая характеристика

регенерации тканей коленного сустава под действием вводимых препаратов производных крови в группах крыс в разные сроки лечения остеоартрита: а – через 2 недели; б – через 4 недели; в – через 6 недель

Через шесть недель после начала эксперимента у животных группы 1 отмечали единичную шероховатость поверхности гиалинового хряща и небольшие участки потери окраски его матриксом. В группе 2 имелись участки шероховатости поверхности хряща, отмечали небольшие очаги замещения хряща соединительной тканью. В группе 3 наблюдали участки замещения соединительной тканью гиалинового хряща с уменьшением его клеточности и окраски матрикса. В контрольной группе крыс визуализировали участки полного замещения соединительной тканью хряща на всю глубину со значительным уменьшением клеточности в данных участках. Наиболее показательные микрофотографии представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Патоморфологическая картина хряща коленного сустава крыс, пролеченных в течение 6 недель с использованием: а – ПОРФТ/PRP; б – плазмы; в – сыворотки; г – физраствора. Окраска: сафранин О. Увеличение ×200

Медиана по MANKIN в группе 1 составила 2,0 (1,0; 2,0) балла. в группе 2 – 6,0 (5,0; 7,0) баллов, в группе 3 – 7,0 (6,0; 7,0) баллов. В контрольной группе медиана баллов была 7,5 (7,0; 8,0). При сравнении групп определяли ( p < 0,001) статистически значимые различия. Межгрупповые различия представлены на рисунке 2, в.

ОБСУЖДЕНИЕ

В нашем исследовании получены патоморфологические данные, указывающие на увеличение кле-точности, снижение шероховатости поверхности и накопление протеогликанов в сохранившемся гиалиновом хряще, при этом участок глубокого дефекта хряща заполнялся соединительной тканью [26]. Полученные данные совпадают с данными систематического обзора A. Boffa et al., в котором указаны похожие изменения у малых лабораторных животных в 28 исследованиях. Во всех представленных в систематическом обзоре исследованиях группу животных, получавших PRP-терапию, сравнивали с животными контрольной группы, которые получали физиологический раствор (saline solution) [20]. В нашем исследовании был показан статистически значимый эффект ПОРФТ/PRPв сравнении с контролем и сывороткой [27-28], который мы связываем с выраженным регенеративным потенциалом ПОРФТ/PRP по сравнению с плазмой крови, не содержащей тромбоциты и растворимые факторы тромбоцитов, и сывороткой крови, содержащей естественный (в 3-5 раза ниже) уровень растворимых факторов тромбоцитов. В работах авторов с использованием других экспериментальных исследований были получены аналогичные данные [26, 29].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данное исследование показало, что внутрисуставное введение модифицированного ПОРФТ/PRP приводило к выраженному терапевтическому эффекту, проявлявшемуся улучшением морфофункционального состояния гиалинового хряща (MANKIN score – 2 балла) на шестые сутки, в сравнении с плазмой и сывороткой.