Патоморфология поджелудочной железы при суперинвазионном описторхозе

Введение. Описторхоз человека – паразитарное заболевание, инициируемое трематодой Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) и являющееся социально значимой проблемой в

Российской Федерации и других странах. Суперинвазионный описторхоз (СО) является заболеванием, затрагивающим многие системы организма, что приводит к снижению актив- ности и потенциала жизни пациентов [1]. На территории России располагается наиболее обширный и мощный очаг описторхоза - Обь-Иртышский бассейн, охватывающий несколько субъектов РФ и северные области Республики Казахстан [2, 3].

Описторхисы имеют уникальные свойства, запускающие продуктивные процессы вследствие мутации пролиферативных генов [4, 5]. Установлено, что регенерация печени после частичной резекции на фоне суперинвазионного описторхоза происходит за счет интенсивной пролиферации стволовых клеток вследствие их дифференцировки в клетки паренхимы и стромы. При СО происходит инициация стволовых клеток печени с последующей их дифферонной дифференцировкой [6-10].

Печень и поджелудочная железа являются эконишами, где длительное время вегетируют паразиты. В поджелудочной железе при суперинвазионном описторхозе их обнаруживают в 30,2-37,4 % случаев. Описторхисы в условиях дуоденальной гипертензии проникают в протоковую систему поджелудочной железы, что приводит к изменению структуры органа [11, 12].

При исследовании поджелудочной железы при суперинвазионной форме опистор-хоза выявляются индуративные изменения головки и тела органа [13]. Однако сведений о динамике пролиферативных изменений в железе с рассмотрением различных гистогенети-ческих путей в литературе не представлено.

Цель исследования. Определить дифференцировку региональных стволовых клеток поджелудочной железы, их пролиферативные процессы в условиях суперинвазионного опи-сторхоза.

Материалы и методы. Для изучения в соответствии с действующим законодательством Российской Федерации и с разрешения локального этического комитета Тюменского государственного медицинского университета (протокол № 98 от 26.02.2021) были отобраны фрагменты ткани поджелудочной железы в патологоанатомических отделениях медицинских учреждений, расположенных на территории гиперэндемического очага опи-сторхоза (Тюменская, Омская области, Хан ты-Мансийский автономный округ). Образцы ткани железы отбирались из всех отделов органа.

Были сформированы следующие группы: I группа - лица, имевшие в анамнезе суперинвазионный описторхоз с длительностью инвазии более 10 лет (n=70); II группа (контрольная) - лица без инвазии, умершие от случайных причин (n=10). Группу лиц с ОС составляли 44 мужчины и 26 женщин (соотношение 1,7/1) в возрасте от 38 до 89 лет. Контрольную группу - 5 мужчины и 5 женщин в возрасте от 42 до 82 лет.

После стандартных гистологических манипуляций срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Ван Гизону. С использованием программы Image Tool for Windows V. 2.04 определяли индекс площади фиброза - отношение площади фиброза (мкм2) к площади препарата (без учета площади просвета сосудов и протоков). Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием маркеров инсулина (клон К36аС10), Chromogranin A (клон PHE5), СК7 (клон ВА4, DakoCytomation), СК18 (клон DC-10) и СК19 (клон 34betaE12), CD34 (клон QBEnd/10), CD31 (клон JC70), CD117 (клон YR145) и Ki-67 (клон MIB-1, Agilent/Dako, RTU). Иммуногистохимические реакции осуществляли в иммуностейнере Autostainer 480S (Thermo Fisher Scientific, США). Время инкубации составляло 30 мин. Изучение стеклопрепаратов проводили на микроскопе AxioLab.Al (Carl Zeiss Microscopy, Германия) с дальнейшей морфометрической оценкой количественных параметров островкового аппарата. На срезах, окрашенных иммуногистохимическими методами, на условной единице площади проводили подсчет клеток, в которых выявлялась экспрессия соответствующих белков. Подсчет иммунопозитивных клеток производили в 20 полях зрения каждого образца при увеличении 400 крат.

Статистическую обработку материала и расчет показателей проводили с использованием статистического пакета программ Statis-tica для Windows v.10 и SPSS v.21, определяли среднее арифметическое и ошибку среднего арифметического (M±m). Достоверность различий сравниваемых средних величин уста- навливали на основании критерия Стьюдента для заданного порога вероятности безошибочных прогнозов. Достоверным считали различие между сравниваемыми рядами при уровне доверительной вероятности 95 % и выше. При p<0,05 считали, что ряды совпадают на 95 % уровне доверительной вероятности. При расчетах учитывали, что распределение исследуемых признаков было близким к нормальному.

Результаты и обсуждение. Описторхи-сы в головке поджелудочной железы встреча- лись в 32,5 % случаев. Вследствие рефлюкса содержимого 12-перстной кишки личинки паразитов в условиях дуоденальной гипертензии проникали в протоковую систему (рис. 1) и увеличивали этот показатель до 48,1 %, здесь отмечалась картина индуратив-ного панкреатита с обширными разрастаниями собственно соединительной ткани. Выявлялись немногочисленные островки Лангерганса, диффузный и периканаликулярный фиброзы.

Рис. 1. Суперинвазионный описторхоз головки поджелудочной железы:

1 – прогениторные клетки, 2 – эпителий протока, 3 – Opisthorchis felineus.

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. ×200

Fig. 1. Superinvasive opisthorchiasis of the pancreatic head. Stained with hematoxylin and eosin. 1 – progenitor cells, 2 – duct epithelium, 3 – Opisthorchis felineus. Magnification ×200

В теле поджелудочной железы пролиферативная активность в единичных скоплениях клеток составляла 14,0 %, однако основную территорию занимала соединительная ткань, индекс площади фиброза достигал 0,88±0,24. Склеротические изменения занимали большие поля, среди которых можно было наблюдать скопление эндокринных клеток и мелких трубчатых структур (рис. 2). В протоках обнаруживались паразиты, каналикулоэктазы и скопления прогениторных клеток (рис. 2).

Наименее измененной частью поджелудочной железы при СО являлась хвостовая часть, индекс площади фиброза достигал 0,14±0,02. В пролиферативный процесс активно вовлекались стволовые прогениторные клетки экзокринного дифферона, о чем свидетельствовала экспрессия цитокератинов 7, 18, 19, кроме этого, отмечалась экспрессия маркера Oct-4 (рис. 3). Пролиферативная активность выстилки протоков составляла 12,0 %.

Рис. 2. Цитоплазматическая экспрессия маркера Cytokeratin 7 в новообразованных протоках поджелудочной железы: 1 – новообразованный островок.

Иммуногистохимическая реакция с Cytokeratin 7. Ув. ×200.

Fig. 2. Cytoplasmic expression of Cytokeratin 7 marker in the newly formed pancreatic ducts. Immunohistochemical reaction with Cytokeratin 7. 1 – newly formed islet. Magnification ×200

Рис. 3. Экспрессия маркера Oct-4 в протоковых структурах хвоста поджелудочной железы.

Иммуногистохимическая реакция с Oct-4. Ув. ×200

Fig. 3. Expression of Oct-4 in the duct structures of the tail of the pancreas.

Immunohistochemical reaction with Oct-4. Magnification ×200

Гистохимическое исследование в островках Лангерганса (ОЛ) позволило идентифицировать эндокриноциты, в-клетки занимали центральное положение и были окружены а-клетками. Площадь ОЛ в контрольной группе составляла 124,72±12,87 мкм2, они были распределены равномерно и достигали плотности 5,17±1,08 в 10 полях зрения.

Эндокриноцитарный индекс, т.е. отношение плотности а-клеток к плотности в-клеток, составлял 0,25±0,04, что соответствовало па- раметрам контрольной группы и данным других авторов [14].

В первой группе постоянно встречались гиперплазированные островки Лангерганса (ГОЛ), которые имели округлую форму и были увеличены в размерах: площадь этих образований составляла 362,14±28,74 мкм2, что достоверно выше в сравнении с обычными островками Лангерганса (р<0,05). ГОЛ были расположены достаточно равномерно и имели плотность 3,21±2,01 в 10 полях зрения (рис. 4).

Рис. 4. Гиперплазированный (1) и новообразованный (2) островки при суперинвазионном описторхозе.

Окраска гематоксилином и эозином. Ув. *200

Fig. 4. Hyperplastic (1) and newly formed (2) islets in super-invasive opisthorchiasis.

Stained with hematoxylin and eosin. Magnification *200

Важно отметить, что обычные и гиперплазированные ОЛ окружены сформированной капсулой, которая при окраске по Ван Ги-зону имела ярко-красный цвет, что свидетельствовало о зрелости данной структуры. В этих островках определялась экспрессия хромогранина А (рис. 5), т.е. клетки данных структур являлись представителями эндокринного дифферона, а также наблюдалась экспрессия глюкагона, но в большей степени инсулина (р<0,05); а-клетки (глюкагонсодержащие) об- наруживались как на периферии островков, так и в центральной части, вблизи капилляров (рис. 6). Эндокриноцитарный индекс в этих ОЛ составлял 0,4±0,06 (р≤0,05). Кроме этого, в гиперплазированных островках Лангерганса наблюдалась экспрессия маркеров CD34, OCT4 и CD117, что свидетельствовало о наличии стволовых клеток в предсуществующих островках. Индекс пролиферативной активности в ГОЛ достигал 3 %.

Рис. 5. Цитоплазматическая экспрессия маркера Chromogranin A в новообразованных островках поджелудочной железы. Группа I. Иммуногистохимическая реакция с Chromogranin A. Ув. ×400

Fig. 5. Cytoplasmic expression of Chromogranin A marker in the newly formed pancreatic islets. Group 1.

Immunohistochemical reaction with Chromogranin A. Magnification ×400

Рис. 6. Цитоплазматическая экспрессия маркера Insulin в новообразованном островке.

Иммуногистохимическая реакция с Insulin. Ув. ×100

Fig. 6. Cytoplasmic expression of Insulin marker in the newly formed islet.

Immunohistochemical reaction with Insulin. Magnification ×100

В поджелудочной железе I группы (умершие с СО) выявлены многочисленные скопления эндокриноцитов площадью 651,01± ±46,17 мкм2, которые располагались достаточно хаотично, местами определялась их скученность, средний показатель числа ново- образованных островков в одном поле зрения составлял 2,45±0,15, в некоторых островках капсула полностью отсутствовала, в части определялся нежный соединительнотканный каркас с небольшим количеством фибробластов (рис. 7, 8).

Рис. 7. Гиперплазированный (слева) и новообразованный (справа) островки поджелудочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. *100

Fig. 7. Hyperplastic (left) and newly formed (right) pancreatic islets. Stained with hematoxylin and eosin. Magnification *100

Рис. 8. Мембранная экспрессия маркера CD117 в гиперплазированном (слева) и новообразованном (справа) островках поджелудочной железы. Иммуногистохимическая реакция с CD117. Ув. *200

Fig. 8. Membrane expression of CD117 marker in hyperplastic (left) and newly formed (right) pancreatic islets. Immunohistochemical reaction with CD117. Magnification *200

В данных структурах определялась экспрессия маркера хромогранина А, а также экспрессия рецепторов гена глюкагона и инсулина (рис. 9). Эндокриноцитарный индекс составлял 0,33±0,02; выявлялась умеренная экспрессия маркера C-kit, что позволяло сделать вывод о том, что при суперинвазионном опи-сторхозе формируются новые структурные образования, так как именно CD117 (рецептор фактора стволовых клеток SCF-R) дает экс- прессию до 2 баллов в данных структурах, что говорит о дальнейшей дифференцировке клеток в эндокриноциты [15]. Кроме этого, вокруг данных структур формировались сосуды, которые давали экспрессию маркера CD31, индекс пролиферативной активности составлял до 11 %, т.е. формирование новообразованных сосудов происходило из прогенитор-ных клеток путем васкулогенеза. Ангиогенез был менее выражен.

Рис. 9. Цитоплазматическая экспрессия маркера Chromogranin A в новообразованных островках поджелудочной железы. Иммуногистохимическая реакция с Chromogranin A. Ув. ×400

Fig. 9. Cytoplasmic expression of Chromogranin A marker in the newly formed pancreatic islets.

Immunohistochemical reaction with Chromogranin A. Magnification ×400

Наблюдался сформированный эндокринный аппарат, образующийся de novo из стволовых клеток под действием секретома (гранулина) Opisthorchis felineus [16]. Новообразованные скопления эндокриноцитов мы назвали островками Каннаямми.

O. felineus в своем жизненном пути имеет определенную стратегию – сохранить и продолжить вид [17, 18]. Именно поэтому одним из доминантных инстинктов, который он реализует, является нутритивный рефлекс. Под действием секретома (гранулина) паразита происходит запуск пролиферации собственных стволовых клеток как в печени, так и в поджелудочной железе, которые являются эконишами, т.е. местом его вегетирования. Кроме секретома, выделяемого паразитом, в последнее время уделяют большое внимание экскреторно-секреторным продуктам, таким как гемозоин, который обусловливает иммуномодулирующее действие на органы-мишени. Выраженная активация стволовых клеток поджелудочной железы приводит к мощному запуску стволовых и транзиторных клеток, что впоследствии ведет к пролиферации эпителия протоков, который является нутрицевтическим субстратом паразита, а также процессу неоангиогенеза. Исследование материалов позволяет представить схему дифференцировки региональных стволовых клеток в поджелудочной железе при суперинвазионном описторхозе (рис. 10). Вполне очевидно, что описторхисы через инициацию региональных стволовых клеток реформируют другие диффероны в соответствии с правилом H. Leduc (1964) [19].

Рис. 10. Дифференцировка региональных стволовых клеток поджелудочной железы при суперинвазионном описторхозе

Fig. 10. Differentiation of regional pancreatic stem cells in super-invasive opisthorchiasis

Заключение. В исследовании выявлено 3 гистологических типа эндокринных образований поджелудочной железы: островки Лангерганса обычного строения, гиперплазированные островки и новообразованные островки Каннаямми. Последний вариант является результатом инициации и дифференцировки стволовых клеток поджелудочной железы при воздействии секретома Opisthorchis felineus. Островки Каннаямми от предсуще-ствующих форм отличаются хаотичным расположением, неопределенной формой, существенно большим размером и отсутствием или наличием формирующейся капсулы; они могут возникать на территории склеротических изменений паренхимы железы. Все новообразованные островки содержат аналогичные клетки, обладающие идентичными свойствами элементов островков Лангерганса.

В работе преимущественно рассматривалось формирование суперинвазионным опи-сторхозом вновь образованного эндокринного аппарата и экзокринные преобразования в поджелудочной железе в соответствии с правилом H. Leduc (1964), относящимся к процессам другой экониши вегетирования O. felineus – печени.