ПЦР-анализ генов альдоксимдегидратаз нитрилутилизирующих бактерий

• ^a Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

• ^b Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

Проведена детекция генов альдоксимдегидратаз у нитрилутилизирующих бактерий, выделенных на территории Пермского края. Установлено, что 14,3% бактерий лабораторной коллекции содержали гены альдоксимдегидратаз. У 12 штаммов рода Rhodococcus (20,3%) присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидратазы. На матрице ДНК одного штамма из группы грамотрицательных микроорганизмов – Pseudomonas fluorescens 3220 - амплифицирована последовательность, соответствующая по размеру гену альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23.

Альдоксимы – это интермедиаты биосинтеза некоторых биологически активных веществ, таких как индолилуксусная кислота, цианогенный гликозид и глюкозинолаты в растениях. Так, индолаце-тальдоксимгидролаза катализирует специфическую дегидратазную реакцию индолацетальдоксима в индолацетонитрил. Этот фермент можно обнаружить в некоторых родах грибов и высших растений, и впервые он выделен из Gibberella sp. (Asano et al., 1981).

У бактерий конверсия альдоксимов в нитрилы, а затем в соответствующие карбоновые кислоты происходит путем сочетания работы ферментов альдоксимдегидратазы и нитрилутилизирующих ферментов – нитрилгидратазы и амидазы и/или нитрилазы (Kato et al., 1998):

альдоксимдегидратаза нитрилгидратаза

R-CH=NOH  ► R-CN + H2O --► R-CONH2 + H2O амидаза

R-CONH2 + H2O --►  R-COOH +NH4+ альдоксимдегидратаза нитрилаза

R-CH=NOH  ► R-CN + H2O --► R-COOH +NH4+

Штаммы – продуценты нитрилгидролитических ферментов имеют важное практическое применение: в крупнотоннажном промышленном производстве акриламида и солей акриловой кислоты (Kobayashi et al., 1992; Yanenko et al., 1995). Несмотря на постоянный поиск новых бактерий в природе, информация о распределении систем гидролиза нитрилов в группах микроорганизмов и их физиологическая роль еще не в полной мере определены. Поэтому внимание исследователей, изучающих нитрилутилизирующие ферменты микроорганизмов, привлекли альдоксимдегидратазы – ферменты, катализирующие альдоксимы до нитрильных соединений. В настоящее время выделены альдоксимтрансформирующие микроорганизмы Bacillus sp. OxB-1 и Rhodococcus sp. YH3-3.

Данные штаммы конвертировали альдоксимы через нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты путем последовательной работы альдоксимдегидратазы и нитрилгидролизующих ферментов (Asano, Kato, 1998).

Процесс отбора штаммов, обладающих активностью альдоксимдегидратазы, может быть ускорен быстрым скринингом с помощью молекулярных методов детекции генов, кодирующих эти ферменты.

Работа посвящена детекции генов альдоксимдегидратаз у бактерий, способных утилизировать нитрилы карбоновых кислот, ранее выделенных из почвы на территории Пермского края.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования являлись бактериальные культуры, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот.

Культуры получены ранее в результате селекции на ацето- и/или изобутиронитриле из образцов почв и вод естественной среды и почвы промышленных предприятий (ФГУП "ПЗ им. С.М. Кирова" и ОАО "Бератон"). Всего проанализирована 91 культура микроорганизмов: 59 штаммов грамположительных бактерий (роды Rhodococcus , Arthrobacter , Miсrobacterium , Citreo-bacterium , Nocardia , Gordonia, Aureobacterium ) и 32 штамма грамотрицательных бактерий (роды Pseudomonas , Azomonas , Azotobacter и Acidovorax ).

Препараты хромосомной ДНК грамположи-тельных бактерий получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из акти-номицетов (Гловер и др., 1988). ДНК грамотрица-тельных микроорганизмов получали следующим образом: полную петлю биомассы бактериальной культуры инокулировали в 100 мкл стерильной

Таблица 1

Праймеры для ПЦР-анализа генов альдоксимдегидратаз

Праймер		Последовательность	Размер фрагмента, пар нуклеотидов	№ в GenBank
PsOxd	F R	ATGGAATCTGCGATCGACACGCATC TCAGGTGGGCGCGACAACGGCATC	1058	АВ093544
RhOxd	F R	ATGGAATCTGCAATCGGCGAACAC TCAGTGCTCGGCGGTTGTCACCG	1069	АВ094201

Н 2 О, выдерживали при 95°С в течение 15 мин в твердотельном термостате «Термит» (Россия) (Stone et al., 1994). Пробы охлаждали, центрифугировали 5 мин при 12 тыс. об./мин. Супернатант использовали в генетических исследованиях.

Детекцию генов альдоксимдегидратаз осуществляли посредством ПЦР с праймерами к генам, кодирующим известные альдоксимдегидратазы грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов. Олигонуклеотидные праймеры были разработаны с использованием баз данных GENBANK и по заданным последовательностям синтезированы ООО «Евроген», Москва (табл. 1).

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq -полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия). Режим амплификации для всех праймеров включал начальный цикл денатурации – 1 мин при 94°С и завершающий цикл 3 мин при 72°С. Для праймеров RhOxd F1/R1 режим амплификации составлял: 94°С – 20 сек; 64°С – 30 сек; 72°С – 60 сек (35 циклов). Для праймеров PsOxd F1/R1: 94°С – 20 сек; 54°С – 70 сек; 72°С – 60 сек (35 циклов). Электрофоретическое разделение ДНК проводили стандартным способом в 1,5% агарозном геле. Визуализацию результатов осуществляли с помощью системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

Результаты исследований

Известна только хромосомная локализация генов, кодирующих альдоксимдегидрогеназы у бактерий (Xie et al., 2003). Гены, контролирующие гидролиз нитрилов, также имеют хромосомную локализацию (Kobayashi et al., 1992).

Установлено, что у 12 штаммов (20,3%) грам-положительных нитрилутилизирующих бактерий присутствовали фрагменты ДНК, соответствующие по размеру гену альдоксимдегидратазы (рис. 1). Все штаммы принадлежали к роду Rhodococcus (из них 11 – R. erythropolis , 1 – R. rhodochrous ).

У штаммов, принадлежащих к родам Microbacterium , Citreobacterium , Nocardia , Gordonia, Aureo-bacterium , не обнаружены фрагменты генов альдоксимдегидратаз ни с одной парой праймеров к генам гидролитических ферментов.

На матрице ДНК одного штамма из группы грамотрицательных микроорганизмов ( Pseudomonas fluorescens 3220) амплифицирована последовательность, соответствующая гену альдоксимдегидратазы P. chlororaphis B23 (Oinuma et al., 2003).

Нужно подчеркнуть, что в большинстве случаев гены альдоксимдегидратазы были детектированы в штаммах (8), содержащих весь комплекс генов, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов: нитрилгидратазу/амидазу и/или нитрилазу (табл. 2).

В трех случаях детектировали ген альдоксимдегидратазы и один из генов, ответственных за синтез гидролитических ферментов.

маркер

о _               —5                                                                                1

-§ |          р                                                   Т

— 7^^:U   —f-   г |   —f-   —f-   г |   —f-   к, к, г |   “ к,   —|-

1 kb-

Рис. 1. Электрофорез ПЦР-продуктов, соответствующих генам альдоксимдегидратаз грамположи-тельных бактерий

Таблица 2

Распределение генов, кодирующих ферменты метаболизма нитрилов у некоторых штаммов изучаемой коллекции

Культура	Гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов
	nhc Fe nhc Co	nh α Fe nh β Fe	ami	nit	oxd
R. rhodochrous К17(Р)	+	+/+	+	+	+
R. erythropolis Б2-4	+	+/+	+		+
R. erythropolis Б4-1	+	+/+	+	+	+
R. erythropolis Б4-3	+	+/+			+
R. erythropolis Б4-4				+	+
R. erythropolis Б5-2	+	+/+	+	+	+
R. erythropolis Б5-5	+	+/+	+		+
R. erythropolis Б20-8	+	-/+	+		+
R. erythropolis ДО-1-1с	+				+
Pseudomonas sр. C3220			+	+	+
R. erythropolis П4-1-3			+		+
R. erythropolis П11-2	+	+	+		+
Rhodococcus sр. П3	+		+		+

Заключение

На основе коллекции нитрилутилизирующих штаммов бактерий исследовано распространение генов альдоксимдегидратаз, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме нитрилов карбоновых кислот. Установлено, что только 14,3% штаммов нитрилутилизирующих бактерий лабораторной коллекции содержали гены альдоксимдегидратаз. Возможно, это связано с вариабельностью фланкирующих участков генов, кодирующих эти ферменты, и используемые праймеры не охватывают все возможные комбинации этих последовательностей.

При оценке распространения генов альдоксимдегидратаз среди микроорганизмов различных таксономических групп показано превалирование представителей рода Rhodococcus , продуцирующих железосодержащие нитрилгидратазы. Следует отметить, что при анализе и других генов, кодирующих гидролитические ферменты, доля этих бактерий была наибольшей.

Метод молекулярного скрининга при помощи ПЦР позволяет быстро идентифицировать альдоксимдегидратазы и может быть использован в процессе селекции альдоксим- и нитрилконвертирующих микроорганизмов.

Полученные результаты подтверждают важную роль альдоксимдегидратаз в метаболизме бактерий.

Работа выполнена при поддержке аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы (2009– 2010 годы)» и программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие»