Real-time PCR for diagnosis of bovine parainfluenza-3

Респираторные заболевания молодняка крупного рогатого скота, вызываемые вирусами парагриппа-3, диареи, инфекционного ринотрахеита и респираторносинцитиальной болезни, представляют собой серьезную проблему для здоровья крупного рогатого скота во всем мире, в том числе и в России. [1, 5]. Наиболее тяжелые последствия среди этих инфекций вызывает вирус ПГ-3.

Вирус парагриппа- 3 (ПГ-3) крупного рогатого скота относится к семейству Paramyxoviridae [9]. Геном вируса представлен однонитевой нефрагментирован-ной РНК негативной полярности, размером порядка 15500 оснований. Белки возбудителя, взаимодействуя с геномной РНК, образуют вирусный нуклеокапсид [3].

Парагрипп-3 крупного рогатого скота (инфекционный бронхит, бронхопневмония, острый катар верхних дыхательных путей, транспортная лихорадка, параинфлуэнца-3) – острое контагиозное заболевание крупного рогатого скота (преимущественно молодняка до 6-месячного возраста), характеризующееся катаральногнойным поражением органов дыхания, лихорадкой, общим угнетением, приступами сухого, болезненного кашля, катаральным конъюнктивитом [2, 4]. Кроме того, у взрослых животных парагрипп-3

может проявляться в виде абортов [8]. Сложность диагностики увеличивается из-за постоянного смешанного течения болезни (осложнение сальмонеллезом, ста-филококкозом, пастереллёзом) [6].

Лабораторная диагностика возбудителя болезни парагриппа-3 крупного рогатого скота обычно выполняется путем выделения вируса в культуре клеток (золотой стандарт), вирус вызывает типичный ци-топатический эффект с образованием синцития и цитоплазматических включений [11]. Молекулярным методом, используемым для диагностики ПГ-3, является ПЦР с предварительной обратной транскрипцией [10, 7].

Целью исследования было определение эффективности полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) с применением тест-системы «ПЦР-парагрипп-3 КРС-фактор» в диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Материал и методы исследований. В работе использовались следующие вирусные штаммы:

• -    «SF-4» – референтный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на перевиваемых линиях культуры клеток легкого эмбриона коровы (ЛЭК) - 7,25 кг ТЦД 50 / мл.

• -    «ПТК-45/86» – вакцинный штамм вируса ПГ-3, инфекционная активность на

перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,75 лг ТЦД 50 / мл.

• -    «ЛД-9» – вирусный изолят, выделенный из патологического материала, взятого от больного респираторным заболеванием теленка, инфекционная активность на перевиваемой линии культуры клеток ЛЭК - 6,25 кг ТЦД 50 / мл.

ПЦР проводили с использованием набора «ПЦР-парагрипп-3 КРС-фактор», согласно инструкции производителя (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Москва-Троицк) на ам-плификаторе ДТ-96 («ДНК-технология», Россия).

Выделение РНК возбудителя из биологического материала осуществляли с применением набора «ДНК / РНК-с- фактор» (ООО «ВЕТ ФАКТОР», Москва-Троицк).

Для экстракции РНК использовали 50 мкл биологического материала. Для процесса амплификации использовали по 10 мкл выделенной РНК при общем объёме реакционной смеси 25 мкл.

Для постановки ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией необходима двухцепочечная ДНК, поэтому амплификации фрагментов генетического материала вируса прагриппа-3 предшествовало преобразование молекулы РНК возбудителя в ДНК путём обратной транскрипции.

Обратная транскрипция и амплификация осуществлялись по режиму, описанному в таблице 1.

Таблица 1 – Температурно-временной режим амплификации на ДТ-96.

№ п/п	Температурно-временной режим	Число циклов
1	55оС-15минут (обратная транскрипция)	1
2	95оС-5мин	1
3	95оС-20сек	45
	58оС-30с, детекция НЕХ, Су5
	72оС-20сек

Результаты исследований. Результаты кривых накоплений флуоресцентного сигнала анализировали с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией к прибору .

Учет результатов ПЦР-РВ проводили по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установлен- ной на соответствующем уровне пороговой линии. На рисунках 1, 2, 3 представлены полученные нами графики амплификации.

В соответствии с вышеизложенным, все использованные нами пробы, как и предполагалось, оказались положительными, т.е показали присутствие вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

Рисунок 1 – График амплификации по флуорофору НЕХ изолята «ЛД-9» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

Рисунок 2 – График амплификации по флуорофору НЕХ вакцинного штамма «ПТК 45/86»

вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

Рисунок 3 – График амплификации по флуорофору НЕХ референтного штамма «SF-4» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота

Таблица 2 - Анализ по номеру цикла по видам штамма

№ п/п	Штамм	Идентификатор	СТ	Качественный анализ
1	Вирусный изолят «ЛД-9»	К-	-	-
		Образец	13,0	+
		К+	23,1	+
2	Вакцинный штамм «ПТК 45/86»	К-	-	-
		Образец	12,1	+
		К+	20,4	+
3	Референтный штамм «SF-4»	К-	-	-
		Образец	14,7	+
		К+	21,0	+

Примечание: К- – отрицательный контроль; К+ – положительный контроль; СТ – номер цикла

На рисунках 1, 2 и 3 показаны графики накопления флуоресценции при постановке ПЦР-РВ со штаммами вируса ПГ-3. Сигналы флуоресценции исследуемых образцов во всех трёх случаях появляются значительно раньше, чем в положительных контролях, что указывает на изначально более высокую концентрацию вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота в пробах. Расшифровка графиков с указанием номеров циклов начала сигнала флуоресценции представлена в таблице 2.

Результаты показали, что значения СТ контрольных образцов находятся в пределах нормы (СТ<31), значит наблюдается экспоненциальный рост сигнала по НЕХ, образец считается положительным, РНК вирус парагриппа-3 крупного рогатого скота присутствует.

Заключение. Результаты исследований методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) известных штаммов (референтный «SF-4», вакцинный «ПТК45/86» и вирусный изолят «ЛД-9») вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, как и предполагалось, оказались положительными, так как РНК вируса ПГ-3 крупного рогатого скота присутствует во всех образцах.

При отрицательных контролях амплификации активности не зарегистрировано. Это говорит о высокой достоверности метода ПЦР-РВ при диагностике ПГ-3 КРС.

Кроме того, система ПЦР в реальном времени обеспечивает дополнительную возможность определить начальное количество целевой ДНК или РНК, присутствующей в образце.

Исходя из вышеизложенного, следует заключить, что полимеразная цепная реакция в реальном времени, основанная на обнаружении генетического материала возбудителя, является надежным, точным и быстрым методом диагностики парагриппа-3 и при этом не требует выделения и культивирования самого вируса.

Резюме

Целью работы было определение эффективности метода ПЦР в диагностике парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота. Для исследований использовали референтный штамм «SF-4», вакцинный штамм «ПТК-45/86» и изолят «ЛД-9» вируса парагриппа-3. В результате проведенных исследований установлена эффективность и высокая скорость постановки ПЦР-РВ с флуоресцентной детекцией в диагностике парагриппа-3 крупного рогатого скота.

Все исследованные штаммы вируса ПГ-3 показали положительную амплификацию.

Summarу

The aim of the work was to determine the effectiveness of the PCR method in the diagnosis of bovine parainfluenza-3 (BPI-3). For research, we used the reference strain SF-4, the vaccine strain PTK-45/86 and the isolate LD-9 of the parainfluenza virus 3. As a result of the studies, the effectiveness and high execution speed of RT-PCR with fluorescence detection for the diagnosis of bovine parainfluenza type 3 were established.

All studied strains of BPIV-3 showed positive amplification.