Передача гена устойчивости к имидазолиноновым гербицидам в селекционный материал подсолнечника во ВНИИМК

В СЕЛЕКЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ

В последние годы большой интерес в борьбе с сорной растительностью в фитоагроценозах представляет новая группа послевсходовых системных гербицидов – имидазолинонов. Эти гербициды поглощаются корнями и листьями растений, прекращая их рост уже через несколько часов, что приводит к гибели организма в течение 2-4 недель в зависимости от вида сорняка и его размеров [1]. Одновременно с созданием новых экологически приемлемых гербицидов, ведущие селекционные компании мира работают над повышением устойчивости культурных растений к гербицидам.

В 2002 г. фирмой BASF запатентованы способ получения устойчивых к имидазолинонам растений и новая устойчивая линия пшеницы. Эти результаты получены с помощью метода генной инженерии. Было доказано, что устойчивость к действию гербицида достигается точковой мутацией в одном кодоне, вследствие чего в белковой молекуле фермента аце-толактатсинтазы аминокислота аспарагин меняется на серин, например, для кукурузы в позиции 621 [5]. Следует отметить, что фермент ацетогидроксикислая синтаза (АНАS) или ацетолактатсинтаза (ALS) присутствует у многих организмов и катализирует биосинтез аминокислот с разветвленной боковой цепью – валина, лейцина и изолейцина. Имидазолиноновые гербициды, воздействуя на ALS неустойчивого растения, ингибируют биосинтез этих аминокислот на начальных стадиях, что вызывает гибель организма.

До настоящего времени подсолнечник, устойчивый к имидазолинонам, методом трансгеноза не получен.

В 1996 г. в штате Канзас, США, на поле, обрабатываемом в течение семи лет имазетапиром, в популяции дикорастущего подсолнечника Helianthus annuus L. были впервые обнаружены устойчивые к имидазолинонам растения. В 1997 г. исследовали образцы дикорастущего подсолнечника, собранные с 14 полей сои, одного поля кукурузы и 11 популяций вдоль автомобильных дорог в радиусе 20 км от исходного поля. Двадцать популяций из 26 содержали около 1 % устойчивых растений [3].

Частота встречаемости полностью резистентных к имазетапиру растений в исходной популяции дикорастущего H. annuus L. составила 9 % при обработке гербицидом в дозе 15Х [4] и, по другим данным, 27 % при дозе 2Х [2]. Данная популяция в дальней-

ПОДСОЛНЕЧНИКА ВО ВНИИМК шем использовалась в качестве источника устойчивости к имидазолиноновым гербицидам. Этот признак был перенесён путём скрещивания устойчивых растений дикорастущего подсолнечника c культурными формами в гербицидоустойчивые линии НА425 и RHA426.

Bruniard J.М. и J.F. Мiller в 2001 г. изучили наследование устойчивости к гербициду имазетапир у подсолнечника. Оценка F₂ и анализирующего скрещивания показала, что устойчивость контролируется двумя генами, один из которых имеет полудоми-нантный тип наследования ( Imr1 ), а другой является геном-модификатором ( Imr2 ). Полная устойчивость подсолнечника, по мнению американских учёных, может быть достигнута только в доминантной гомозиготе ( Imr1Imr1 Imr2Imr2 ) по двум генам устойчивости в инбредных линиях или гибридах.

Молекулярно-генетическое изучение гербицидо-устойчивости у подсолнечника показало наличие замены C на T в кодоне 205 гена AHAS1 . Эта Ala205Val мутация приводит к устойчивости ALS фермента по отношению к имидазолинонам [7].

Аlonso L. C. с сотрудниками в 1998 г. обнаружили факт гибели заразихи на корнях гербицидоустойчивого подсолнечника после обработки гербицидом растений на стадии 3-х пар листьев в вегетационном опыте при искусственном внесении семян заразихи в почву. Этот факт объясняется тем, что имидазолино-ны (имазетапир и имазамокс), являясь гербицидами системного действия, проникают через поверхность листьев по флоэме к корням растения-хозяина и уничтожают заразиху. При этом растение-хозяин – гербицидоустойчивый подсолнечник, не страдает от воздействия имидазолинона. Ценность этого химического метода может заключаться в борьбе с новыми агрессивными расами заразихи [2].

В сильно инфицированных заразихой расы F районах Испании было проведено полевое испытание четырех гербицидоустойчивых гибридов подсолнечника. В результате наблюдали снижение поражаемо-сти растений заразихой при их обработке имазамоксом на стадии 3-х и 9-ти пар листьев. При этом урожай семян увеличился на 15 % по отношению к пораженным участкам [6].

Один из первых межлинейных ИМИ-устойчивых гибридов подсолнечника Rimisol был создан в 2002 г. в Институте полевых и овощных культур, г. Нови Сад, Сербия. Разрабатываемая в настоящее время фирмой BASF агротехнология выращивания подсолнечника CLEARFIELD включает два компонента: ИМИ-устойчивый гибрид и имидазолиноновый гербицид EuroLightning (имазапир + имазамокс).

Таким образом, спонтанная устойчивость к имидазолиноновым гербицидам, найденная в популяции дикорастущего подсолнечника, открывает новую возможность борьбы селекционно-генетическими методами с распространением таких опасных сорняков, как заразиха, амброзия и осот. В связи с этим, перед нами возникла цель введения гена (генов), контролирующего гербицидоустойчивость, в селекционный материал подсолнечника ВНИИМК. В задачи исследования были включены: оценка гербицидоустойчивости как подсолнечника, так и заразихи; гибридизация и изучение наследования этого признака; создание константных ИМИ-устойчивых линий при самоопылении и отборе.

Материал и методы . Исследования проводились на ЦЭБ ВНИИМК, г. Краснодар в 2003-2007 гг. В работе использовались сорт, линии и образцы подсолнечника различного происхождения. Гербицидоустойчивые линии подсолнечника HA425 и RHA426 получены из коллекции Департамента сельского хозяйства, г. Фарго, США. Использованы также сорт Юбилейный 60, селекционные линии ВНИИМК (ВК276, ВК464, ВК508, ВК541, ВК585, ВК653, ВК876, ВА2, ВА93, ВА317, ВА325), линии генетической коллекции ВНИИМК (ЛГ26, ЛГ27, ЛГ28), линии ВИР (ВИР721, К235, К824, К1787, К3353), линия из Франции (RIL100), линии из США (HA413, RHA416), образцы из Сербии (SURES-B, SURES-R). Кроме того, изучены образцы семян, собранных с четырех сорных растений подсолнечника на соевом поле в 2005 г. при его обработке пульсаром в дозе 1 л/га (корзинки от свободного цветения). Всего изучен 31 образец.

В опытах 2003-2004 гг. использовались водные растворы гербицида пивот (д.в. имазетапир), а в 2005-2007 гг. – гербицида пульсар (д.в. имазамокс) в дозе 6 мл/л или 2Х, что соответствует около 1 л/га. Растения опрыскивали ручным пульверизатором в фазе 3-х пар настоящих листьев (V6).

Опыт по оценке влияния имидазолинонов на поражение заразихи на растениях подсолнечника проводился в камере фитотрона с 16 марта по 20 апреля 2006 г. Использовались светильники Фотос.4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещенность 25 килолюкс при 16-часовом световом дне и дневной температуре воздуха около 27-30 оС. В короб с почвенно-песчаной смесью (2:1) высевались семена неустойчивых к заразихе линий – селекционной ВК508 и гербицидоустойчивой RHA426. Почва в коробе была искусственно инфицирована смесью семян заразихи (сбор в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области в 2004 г.), любезно предоставленных отделом селекции сортов подсолнечника, из расчёта 5 г семян заразихи на 10 кг почвы.

На стадии 3-х пар настоящих листьев гербицидом пульсар было обработано по 20 растений линии ВК508 и линии RHA426. Кроме того, 20 растений последней линии не обрабатывались (контроль). Концентрация гербицида составила 3 мл/л, т. е. IХ дозировка. Через 10 дней была произведена оценка влияния гербицида на растения, после чего растения были выкопаны для подсчёта клубеньков заразихи на корнях, а также оценки размера клубеньков и их морфологического состояния после воздействия гербицида.

Клубеньки на корнях растений были классифицированы как жёлтые ( жк ) – жизнеспособные клубеньки; потемневшие ( пк ) – клубеньки заразихи, остановившиеся в развитии, с начальными стадиями некроза тканей; некротические клубеньки ( нк ) – погибшие клубеньки тёмного цвета.

Результаты и обсуждение . Все растения 29 изученных генотипов, в среднем, по 20 растений на образец, погибли после обработки имидазолинонами в полевых условиях. Линии HA425 и RHA426 подтвердили уникальный гербицидоустойчивый фенотип, известный из литературных источников.

Отсутствие гербицидоустойчивых растений подсолнечника в потомстве особей, выживших после использования пульсара на соевом поле, объясняется, вероятно, отсутствием их контакта с гербицидом из-за прикрытия листьями сои в момент обработки относительно позже взошедшей «падалицы» подсолнечника.

Семена F 1 получены летом 2003 г. в следующих комбинациях скрещиваний: НА425 (imi- устойчивость) × ВК876 ( Ol, tph1, tph2 ) и RHA426 (imi- устойчивость) × ВК508 ( Ol ). В камере фитотрона зимой 2003-2004 гг. получены семена F₂.

Летом 2004 г. в поле были одновременно выращены и обработаны гербицидом растения P, F1 и F2. Изучение наследования гербицидоустойчивости показало неполное доминирование этого признака у гибридов первого поколения, выражающееся в уменьшении высоты гетерозиготных растений на 62 и 40 см по двум комбинациям скрещивания соответственно (табл. 1). При этом уменьшения числа листьев не наблюдалось.

Таблица 1 – Высота растений родительских линий и гибридов F₁ при обработке гербицидом пивот

ЦЭБ ВНИИМК, 2004 г.

Генотип	Высота растений, см		Число листьев, шт.
	обработка	контроль	обработка	контроль
НА425	102	98	-	-
	НСР 05 =11
RHA426	136	136	-	-
	НСР 05 =18
HA425 × ВК876	114	176	34	33
	НСР 05 =7		НСР 05 =4
RHA426 × ВК508	164	204	29	30
	НСР 05 =11		НСР 05 =2

В популяции гибридов второго поколения в обоих случаях обнаружено расщепление по моногенной схеме – 3 устойчивых : 1 погибший. Для скрещивания HA425 × ВК876 фактическое отношение составило 98:32 (χ23:1= 0,01) и для RHA426 × ВК508 – 54:18 (χ2 3:1= 0). Появление в популяции F2 в пределах фенотипического класса «устойчивый» угнетенных в различной степени растений, возможно, указывает, наряду с неполным доминированием, на наличие генов-модификаторов (рис. 1). Для дальнейшей работы получено F3 (I1F2).

тогда как в семи популяциях F3 наблюдалось расщепление 3:1, что также согласуется с моногенной схемой наследования (табл. 2).

Таблица 2 – Наследование гербицидоустойчивости в скрещивании HA425 × ВК876

ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Поколение, популяция	Число растений, шт.		χ2 3:1 (χ2 05 =3,84)
	устойчивых	погибших
HA425 ♀	20	0	-
ВK876 ♂	0	14	-
F 1	19	0	-
F 2	98	32	0,01
F 3 , №1	24	0	-
2	16	6	0,06
3	23	0	-
4	27	0	-
5	19	4	0,40
6	22	0	-
7	20	3	1,75
8	12	3	0,20
9	19	6	0,01
10	20	5	0,33
11	21	5	0,46
12	20	0	-

В

С

Рисунок 1 – Фенотипические классы по гербицидо-устойчивости через 10 дней после обработки пиво- том

(А – полностью устойчивый; B – промежуточный; C – восприимчивый)

Пять популяций гибридов F 3 скрещивания HA425 × ВК876 состояли только из устойчивых растений, 20

Дальнейшее самоопыление и отбор устойчивых растений позволили создать 44 константные по гер-бицидоустойчивости линии F5: 22 закрепителей стерильности и 22 – восстановителей фертильности

(табл. 3 и 4). Важно, что эти линии после обработки растений гербицидом показывают при самоопылении высокий уровень фертильности.

Таблица 3 – Гербицидоустойчивые константные

В-линии подсолнечника (F 5 HA425 × ВК876) после обработки пульсаром

ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия	Период всходы-цветение, дни	Высота растения, см	Число семянок в самоопылен-ной корзинке, шт.
Ими-В1	54	58	37
Ими-В2	53	71	135
Ими-В3	56	70	112
Ими-В4	52	66	134
Ими-В5	52	87	346
Ими-В6	52	70	274
Ими-В7	56	62	84
Ими-В8	52	62	56
Ими-В9	52	57	183
Ими-В10	56	56	137
Ими-В11	56	81	307
Ими-В12	56	81	692
Ими-В13	64	88	259
Ими-В14	63	98	405
Ими-В15	50	88	351
Ими-В16	69	71	479
Ими-В17	56	85	271
Ими-В18	64	99	646
Ими-В19	56	58	270
Ими-В20	56	87	60
Ими-В21	56	84	42
Ими-В22	69	120	470
Среднее	57	77	261

RHA426, причём полностью отсутствовали погибшие клубеньки. Наибольшее количество потемневших и некротических клубеньков отмечено у обработанной гербицидом линии RHA426 (рис. 2).

Таблица 4 – Гербицидоустойчивые константные R-линии подсолнечника (F₅ RHA426 × ВК508) после обработки пульсаром

ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия	Период всходы-цветение, дни	Высота растения, см	Число семянок в самоопылен-ной корзинке, шт.
Ими-R1	62	103	239
Ими-R2	64	120	35
Ими-R3	57	126	326
Ими-R4	58	131	521
Ими-R5	59	112	169
Ими-R6	56	110	184
Ими-R7	52	84	107
Ими-R8	56	117	323
Ими-R9	57	134	401
Ими-R10	57	120	335
Ими-R11	65	111	136
Ими-R12	56	118	238
Ими-R13	59	125	362
Ими-R14	62	109	198
Ими-R15	60	116	291
Ими-R16	56	107	172
Ими-R17	57	102	226
Ими-R18	56	116	186
Ими-R19	60	124	311
Ими-R20	57	132	349
Ими-R21	58	126	399
Ими-R22	56	103	132
Среднее	59	116	256

Измерение высоты растений в опыте по изучению влияния гербицида на заразиху показало, что обработанная линия ВК508 (погибшие растения) в среднем была на 6,9 см ниже, чем линия RHA426. Это объясняется влиянием гербицида на восприимчивую линию ВК508, рост которой остановился после обработки растений пульсаром на 3-й паре листьев. Растения гербицидоустойчивой линии RHA426, напротив, продолжили рост (табл. 5).

Таблица 5 – Влияние гербицида пульсар на поражение заразихой подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2006 г.

Линия	Высота растения, см	Количество клубеньков заразихи, шт./растение
		общее	жк	пк	нк
ВК 508 обработанная	10,2	4,0	0,3	1,1	2,6
RHA 426 обработанная	17,1	11,0	4,0	6,3	0,7
RHA 426 не обработанная	17,1	13,0	12,7	0,3	0,0

Примечание: жк – жёлтые клубеньки, пк – потемневшие клубеньки, нк – некротические клубеньки.

Наибольшее число клубеньков заразихи на корнях имела необработанная линия RHA426, в среднем, 13 штук на растение. Наличие клубеньков на погибших от гербицида растениях линии ВК508, по-видимому, связано с внедрением заразихи на более ранних стадиях развития растения, т. е. до обработки пульсаром.

Наибольшее количество жёлтых жизнеспособных клубеньков наблюдалось на необработанной линии

Рисунок 2 – Влияние гербицида пульсар на заразиху у линии RHA426

(верхний снимок – обработка; нижний – контроль)

Измерение величины клубеньков показало, что наибольший размер (до 9 мм) имели жизнеспособные клубеньки на корнях необработанной линии RHA426 (табл. 6). Некротические клубеньки на обработанной линии RHA426 были меньшего размера (до 4 мм).

Таблица 6 – Размер и общее число клубеньков заразихи на корнях растений линий подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия, обработка	Средняя величина клубеньков, мм			Общее число клубеньков, шт.
	жк	пк	нк	жк	пк	нк
ВК 580 обработанная	0,8	0,9	0,7	7	22	53
RHA 426 обработанная	0,6	1,2	1,7	80	127	14
RHA 426 не обработанная	1,9	1,0	0,0	254	6	0

Примечание : жк – жёлтые клубеньки, пк – потемневшие клубеньки, нк – некротические клубеньки .

Заключение. В генофонде 29 образцов культурного подсолнечника не обнаружено признака устойчивости к имидазолиноновым гербицидам. Американские линии HA425 и RHA426 подтвердили гербицидоустойчивый фенотип, который контролировался одним геном с неполным доминированием. На основе соответствующего скрещивания этих доноров с селекционными линиями ВНИИМК ВК876 и ВК508 с последующим самоопылением и отбором устойчивых растений создан новый селекционный материал в виде 44 константных линий F5. В лабораторных условиях установлен факт гибели заразихи при обработке гербицидом пульсар генетически восприимчивых к заразихе гербицидоустойчивых растений подсолнечника линии RHA426. Этот факт позволит использовать химический метод борьбы с новыми расами цветкового паразита на время, необ- ходимое для селекционного создания устойчивых сортов и гибридов подсолнечника.