Перспективный штамм 14-3 Pseudomonas chlororaphis для микробиологической защиты сои от фузариоза

Введение . Фузариоз является одной из наиболее вредоносных болезней сои. Существует несколько типов проявления этой болезни: гибель точки роста, пятнистость листьев, загнивание бобов и семян, но наиболее распространёнными являются гниль корней и трахеомикозное увядание растений. Проявления фузариоза зависят от физиологического состояния растений, степени их устойчивости, инфекционной нагрузки, специфической физиологической активности возбудителя (быстрота роста, образования токсинов, ферментов и т. д.) [1– 4].

Наиболее интересным подходом в борьбе с фузариозными заболеваниями растений является использование живых культур микроорганизмов [5]. Важную роль в борьбе с фузариозом играют бактерии, которые имеют ряд преимуществ перед грибными антагонистами благодаря быстрому размножению, высокой воспроизводимости популяции в ризосфере и устойчивости к фунгицидам [6]. Многие бактерии продуцируют антибиотики, подавляющие или замедляющие рост и развитие фитопатогенов [7; 8]. Также доказано ростостимулирующее влияние бактерий на растения благодаря способности синтезировать ауксины, цитокинины и гиббереллиноподобные вещества [9– 11].

Грамотное и своевременное применение микробиологических средств защиты растений на фоне высокой агротехники может значительно улучшить фитосани-тарную обстановку в посевах и существенно увеличить урожай, поскольку микробиопрепараты обладают специфичностью и сложными механизмами действия на растения и других членов агроценозов, способны решить проблему резистентности популяций фитопатогенов к пестицидам. Поэтому разработка эффективного и экологически безопасного бактериального микробиологического препарата для снижения вредоносности фузариоза сои является актуальной.

Материалы и методы . Объектом исследований служили: штаммы бактерий - антагонистов возбудителей болезней масличных культур, тест - культура возбудителя фузариоза сои Fusarium sporotrichioides Sherb. , опытные образцы микробиопрепаратов, районированные сорта сои.

Активные штаммы антагонистов фитопатогенов наращивали на подобранных питательных средах. Титр лабораторных образцов микробиопрепаратов во всех опытах определяли методом Коха [12]. Защитный эффект жидких культур (ЖК) и водных суспензий (ВС) штаммов-антагонистов для прорастающего семени сои и подбор оптимальных норм их применения определяли на фоне искусственного заражения семян сои F. sporotrichioides Sherb в лабораторных условиях во влажной камере методом агаровых блоков при 25 °С [13]. Контроль – семена без обработки биопрепаратами без внесения инфекции и с инфекцией. Биологическую эффективность штаммов-антагонистов на фоне искусственного заражения почвы фузариозом проводили в вегетационных сосудах, содержащих смесь почвы и песка (в соотношении 3:1), в каждый рядок вносили по 5,0 г инокулюма. После внесения патогена осуществляли высев семян сои (5 штук в рядок), обработанных ЖК и ВС штаммов-антагонистов. Опыт проводили при температуре +25 °С. Для определения эффективности обработки семян сои опытными образцами микробиопрепаратов в полевых условиях против фу-зариоза, посев мелкоделяночных опытов осуществляли 4-рядной селекционной сеялкой СКС-6А с междурядьями 70 см. Густота стояния 250–300 тыс. раст./га. Площадь делянки 14 м2, повторность 3-кратная. Учёты поражения сои фуза- риозом проводили по разработанной нами шкале [14].

Биологическую эффективность опытных образцов микробиопрепаратов определяли по формуле [15]:

C = 1 О О •х (а - b ) а , где C - биологическая эффективность, %;

a - количество больных растений в контроле;

b - количество больных растений в варианте.

Механизм взаимодействия бактериального штамма - антагониста с возбудителем фузариоза сои изучали модифицированным методом двойных культур [16]. Наблюдения за развитием патогена и антагониста проводили ежедневно с помощью светового микроскопа.

Результаты и обсуждение . С целью создания эффективного бактериального микробиопрепарата нами ранее было протестировано 26 бактериальных штаммов - антагонистов фитопатогенов, представленных родами Pseudomonas и Bacillus , из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК. На первом этапе скрининга бактерий с антагонистическим действием к возбудителю фузариоза сои F. sporotrichioides Sherb. при двух температурных режимах 25 и 10 ºС наибольшую эффективность показали три штамма: 12 -2 Pseudomonas sp. , 14-3 P. chlororaphis и Б -5 B. licheniformis [17].

Следующий этап скрининга заключался в изучении влияния указанных перспективных бактериальных штаммов-антагонистов возбудителей фузариоза на культуру сои. Исследования показали, что тестируемые штаммы не оказывают негативного влияния на всхожесть семян и не вызывают увядания проростков. Более того, отмечено ростостимулирующее влияние перспективных штаммов-антагонистов на проростки, в особенности на длину и массу корня. Максимальное увеличение длины корня наблюдалось у штамма 14-3 P. chlororaphis (на 17,5 %), максимальное увеличение мас- сы корня - у 12-2 Pseudomonas sp. (на 20,0 %) и 14-3 P. chlororaphis (на 13,3 %). Влияние штаммов-антагонистов на длину и массу стебля также отмечено, но в меньшей степени [18].

Определение защитного эффекта перспективных штаммов - антагонистов на прорастающие семена сои, а также отработку оптимальных норм расхода опытных образцов микробиопрепаратов проводили в условиях влажной камеры . Испытывались нормы расхода от 0,5 до 3,0 л/т (табл . 1).

Таблица 1

Биологическая эффективность обработки семян сои сорта Ника опытными образцами микробиопрепаратов на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях

Вариант	Норма расхода, л/т	Поражено фузарио-зом, %	Биологиче ская эффективность, %
Контроль без инфекции	-	37,3	-
Контроль + инфекция	-	58,6	-
ТМТД, эталон, ВСК	6,0	20,0	65,9
12-2 Pseudomonas sp ., ЖК	0,5	41,4	29,9
	1,0	20,0	65,9
	2,0	54,7	6,6
14-3 P. chlororaphis , ЖК	1,0	29,4	49,8
	2,0	28,0	52,2
	3,0	46,7	20,3
Б-5 B. licheniformis , ЖК	1,0	36,0	38,6
	2,0	32,0	45,4
	3,0	30,7	47,6

Примечание: ВСК - водно-суспензионный кон центрат, ЖК - жидкая культура

На фоне поражения фузариозом в контроле 58,6 % максимальная биологическая эффективность установлена у штаммов 12-2 Pseudomonas sp. с нормой расхода 1,0 л/т (65,9 %), 14-3 P. chloro-raphis с нормой расхода 2,0 л/т (52,2 %) и Б-5 B. licheniformis с нормой расхода 3,0 л/т (47,6 %). Данные нормы расхода опытных образцов микробиорепаратов признаны оптимальными и использовались во всех последующих опытах.

Следующим этапом вторичного скрининга было определение эффективности опытных образцов микробиопрепаратов на фоне искусственного заражения семян сои возбудителем фузариоза в почве в лабораторных условиях. Биологическая эффективность испытываемых штаммов-продуцентов, на жёстком фоне поражения фузариозом в контроле 78,7 %, составила от 1,8 до 20,3 % при биологической эффективности химического эталона ТМТД, ВСК - 13,6 %. Максимальную биологическую эффективность проявил штамм 14-3 P. chlororaphis - 20,3 % (табл. 2).

Таблица 2

Биологическая эффективность обработки семян сои сорта Славия опытными образцами микробиопрепаратов на фоне искусственного заражения почвы

Вариант	Титр, КОЕ/мл	Норма расхода, л/т	Поражено проростков, %	Биологи-ческая эффек-тив-ность, %
Контроль без инфекции	-	-	7,8	-
Контроль с инфекцией	-	-	78,7	-
Эталон ТМТД, ВСК	-	6,0	68,0	13,6
12-2 Pseudomonas sp., ЖК	7,4 х 1012	1,0	73,3	6,9
14-3 P . chlororaphis, ЖК	5,8 х 1012	2,0	62,7	20,3
Б-5 B. licheniformis , ЖК	3,0 х 1010	3,0	77,3	1,8

Примечание: ВСК - водно-суспензионный концентрат, ЖК - жидкая культура

Следующим этапом скрининга стало испытание штаммов-продуцентов на естественном фоне заражения возбудителем фузариоза в полевых условиях на мелко-деляночных опытах (табл. 3).

На фоне поражения сои фузариозом в контроле 49,1 % максимальная биологическая эффективность отмечена при обработке семян опытными образцами микробиопрепаратов на основе штаммов 14-3 P chlororaphis (25,7 %) и 12-2 Pseudomonas sp. (23,4 %) при эффективности химического эталона ТМТД 10,8 %. Существенный сохранённый урожай полу- чен в вариантах со штаммами 14-3 P. chlororaphis и Б-5 B. licheniformis (0,15 т/га).

Таблица 3

Биологическая эффективность обработки семян сои сорта Альба опытными партиями микробиопрепаратов против фузариоза в полевых условиях

Вариант	Норма расхода, л/т	Поражено фуза-рио-зом (2 + 3 балла), %	Биоло-гичес-кая эффек-тив-ность, %	Урожай-ность, т/га	Сохранён-ный урожай, т/га
Контроль, б/о	-	49,1	-	1,64	-
ТМТД, ВСК, эталон	6,0	43,8	10,8	1,77	0,13
12-2 Pseudomonas sp. , ЖК	1,0	37,6	23,4	1,70	0,06
14-3 P. chlo-roraphis, ЖК	2,0	36,5	25,7	1,79	0,15
Б-5 B. licheni-formis , ЖК	3,0	48,1	2,0	1,79	0,15
НСР 05				0,13

Примечание: ВСК - водно-суспензионный концентрат, ЖК - жидкая культура

Объединив весь спектр полученных в результате ступечатого скрининга данных, наиболее эффективным признан штамм 14-3 Pseudomonas chlororaphis , обеспечивающий защиту семян и проростков сои на жёстком фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза во влажной камере и в почве, а также в полевых условиях, активно колонизирующий корень, одновременно оказывающий ростостимулирующее влияние на культуру сои [17; 19].

Разработка эффективных микробиопрепаратов для защиты растений от болезней предполагает изучение механизмов взаимодействия штаммов-продуцентов с патогенами. При изучении взаимодействия штамма-продуцента микробиопрепарата 14-3 P. chlororaphis с возбудителем фузариоза сои F. sporotri-chioides морфологические изменения мицелия патогена отмечены на пятые сутки совместной инкубации: задержка в росте мицелия патогена по сравнению с контролем. На седьмые сутки патоген в контроле занял всю площадь питательной среды, тогда как в варианте с антагонистом только 50 %, при этом диаметр антибиотической зоны составил 28 мм. Вблизи зоны наблюдалось угнетение, частичный лизис и морфологические изменения мицелия патогенного гриба. К десятым суткам совместного культивирования диаметр антибиотической зоны несколько уменьшился и составил 26 мм, оставшись неизменным (рис. 1).

Рисунок 1 – Влияние штамма 14-3 P. chlororaphis на возбудителя фузариоза сои F. sporotrichioides на десятые сутки инкубации (ориг.):

1 – чистая культура патогенного гриба;

2 – патогенный изолят возбудителя фузариоза (а) + бактериальный штамм антагониста (б)

При микроскопировании мицелия патогена на пятые сутки совместной инкубации наблюдалось нехарактерное интенсивное ветвление гиф (рис . 2.1). Кроме того, в отличие от контроля (рис . 2.2), где субстратный мицелий имел прямонаправленный рост, в варианте с антагонистом, ранее нормально сформированные гифы патогена изменяли направление своего роста в стороны. Большая часть свежеобразованных гиф патогена вместо продвижения вперёд по субстрату тянулась вверх, активно формируя воздушную часть мицелия. Также отмечена задержка удлинения апикальных гиф, которые истончались к концу и отличались меньшим диаметром.

Рисунок 2 – Мицелий возбудителя фуза-риоза сои F. sporotrichioides на пятые сутки инкубации (ориг.):

1 – совместно с антагонистом 14-3 P. chlororaphis :

а – задержка удлинения апикальных гиф;

б – интенсивное ветвление гиф;

в – изменение направления роста; г – истончение апикальных гиф; 2 – без антагониста (контроль)

На седьмые сутки совместной инкубации отмечалась агрегация мицелия пато- гена в тяжи – плотные и однородные сплетения гиф. Более того, отдельные тяжи скручивались в огромные бесформенные узлы (рис. 3.1). При этом в контрольном варианте наблюдался нормальный рост и развитие мицелия гриба (рис. 3.2).

Рисунок 3 – Мицелий возбудителя фуза-риоза сои F. sporotrichioides на седьмые сутки инкубации (ориг.):

1 – совместно с антагонистом 14-3 P. chlororaphis : а – агрегация мицелия патогена в тяжи; б – сплетение тяжей в узел;

2 – без антагониста (контроль)

К десятым суткам совместного культивирования вблизи антибиотической зоны наблюдалась деградация мицелия патогена. Отдельные гифы патогена в тяжах разрывались, вследствие чего происходил распад узлов и гибель мицелия (рис . 4.1).

На пятнадцатые сутки культивирования вблизи зоны взаимодействия деградация и гибель мицелия патогена усугублялась .

Таким образом, нами установлено, что исследуемый бактериальный штамм 14-3 P. chlororaphis обладает фунгистатиче-ским антибиотическим антагонизмом, то есть способен выделять антибиотические вещества, под воздействием которых происходит ингибирование роста колонии патогена с образованием между ними пустой, «стерильной» зоны .

Рисунок 4 – Мицелий возбудителя фуза-риоза F. sporotrichioides на десятые сутки культивирования (ориг.):

1 – совместно с антагонистом 14-3 P. chlororaphis : а – разрыв отдельных гиф патогена; 2 – контроль (без антагониста)

Антибиотическую активность штамма - продуцента микробиопрепарата 14 -3 P. chlororaphis к возбудителю фузариоза F. sporotrichioides определяли в зависимости от срока периодического культивирования штамма на жидкой среде Кинга В методом диффузии в агар. Установлено, что максимальная антибиотическая активность штамма 14 - 3 к возбудителю фузарио-за сои отмечена на третьи сутки периодического культивирования. Действие антифунгальных веществ фильтрата жидкой культуры штамма - антагониста при культивировании в течение 8–48 ч активно преодолевалось патогеном уже к третьим суткам инкубации. Максимальная концентрация антибиотических веществ, оказывающих стойкое сдерживающее действие на патоген, образовалась в культуральной жидкости штамма через 72–96 ч культивирования и сохранялась неизменной до конца эксперимента (рис . 5) [19].

Рисунок 5 – Ингибирование роста патогенного изолята возбудителя фузариоза в зависимости от срока периодического культивирования бактериального штамма - антагониста 14 -3 P. chlororaphis на 15 - е сутки инкубации:

а – контроль ( F. sporotrichioides ) без добавления ЖК штамма 14-3; б – тест-объект + ЖК штамма 14-3 при культивировании в течение 72 ч;

в – тест-объект + ЖК штамма 14-3 при культивировании в течение 96 ч

Для производства эффективного микробиопрепарата необходимо получение культуры с высокой плотностью микробных клеток в сочетании с максимальной концентрацией антифунгальных веществ. С этой целью изучали физиологические признаки перспективного штамма 1 4-3 P. chlo-roraphis : оптимальные питательные среды, источники углеродного и азотного питания, температуру культивирования и кислотность среды. В результате исследований установлено, что при производстве микробиопрепарата на основе бактериального штамма 14 -3 P. chlororaphis глубинное культивирование следует осуществлять на пептон - дрожжевой питательной среде, Чапека или Кинга В при температуре 25– 30 ^оС, кислотность среды должна быть в пределах 5–10, в качестве источников углеродного питания можно использовать глюкозу, сахарозу, глицерин или мелассу, азотного питания – дрожжевой экстракт или пептон [19].

Выводы. В результате ступенчатого скрининга отобран перспективный бактериальный штамм-продуцент микробио- препарата 14-3 P. chlororaphis, обеспечивающий эффективную защиту семян и проростков сои на жёстком фоне искусственного заражения возбудителем фуза-риоза, а также на естественном фоне поражения в полевых условиях, обладающий ростостимулирующим влиянием на проростки сои. Изучен механизм действия штамма-продуцента 14-3 P. chloro-raphis в отношении фитопатогенного гриба F. sporotrichioides, который заключается в синтезе антибиотических веществ, разрушающих мицелий патогена на 7–10 сутки. Разработаны элементы технологии производства и применения лабораторного образца бактериального микробиопрепарата на основе штамма-продуцента 14-3 P. chlororaphis.