Перспективы использования высокоэффективной жидкостной хроматографии для стандартизации сырья и препаратов бессмертника песчаного

в цветках бессмертника песчаного к преобладающим флавоноидам относятся халкон изо-салипурпозид, флаваноны салипурпозид, пру-нин и нарингенин [2-7], однако нет единой точки зрения, какой из этих компонентов является доминирующим. В бессмертнике песчаном содержится также ряд сопутствующих веществ, включая кумарины, коричные кислоты, фталиды, полисахариды и др. [2], которые вносят вклад в спектральные характеристики анализируемых извлечений, что, на наш взгляд, может приводить к завышению результатов анализа.

Цель исследований – разработка методики количественного определения изосали-пурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» с использованием ВЭЖХ.

Материал и методы. Исследовали образцы цветков бессмертника песчаного, собранные в различных регионах РФ, промышленные образцы сырья производства ОАО «Красногорсклексредства» (Московская обл.), а также образцы лекарственного средства «Фламина таблетки» (АО «Галичфарм», г. Львов). В ходе разработки методики количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также растворов изосалипурпо-зида ( 1 ), салипурпозида ( 2 ), 5,7-дигидрокси-фталида ( 3 ) и 5-гидрокси-7-метоксифталида

( 4 ), выделенных из цветков бессмертника песчаного.

Glc O O

Салипурпозид ( 2 )

5-Метокси-7-гидроксифталид ( 4 )

Регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena).В основу разработанной нами методики количественного определения положены следующие оптимальные параметры: экстракция сырья 70% этиловым спиртом в течение 1 часа в условиях кипения в соотношении 1:50 [4]. ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром–5» в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2 мм х 80 мм), стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система – ацетонитрил: вода в соотношении 25:75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования – 100 мкл/мин, объем вводимой пробы – 5 мкл. Детекцию веществ осуществляли при пяти длинах волн 254, 270, 290, 330 и 360 нм. Выбор длин волн обусловлен тем, что исследуемые вещества имеют максимумы поглощения при 372 нм (изосалипурпозид), 284 нм (салипурпозид), 256 нм и 292 (5,7-дигидроксифталид, 5-гидрокси-7-метоксифталид), 330 нм (гидроксикоричные кислоты). Опорная и аналитическая длина волны при разметке пиков – 360 нм, так как целевым анализируемым веществом является изосалипурпозид, имеющий максимум поглощения при длине волны 372 нм (рис. 1).

Рис. 1. УФ-спектр раствора изосалипурпозида

Результаты и их обсуждение. Сравнительное исследование извлечения из цветков бессмертника песчаного (рис. 2) и раствора лекарственного средства «Фламина таблетки» (рис. 3) показало, что, несмотря на некоторые различия в их компонентном составе, в обоих случаях доминирующим компонентом является изосалипурпозид. Сравнение значений времени удерживания пиков веществ (пики 1-5) на ВЭЖХ-хроматограмме извлечения из цветков бессмертника песчаного (рис. 2) и раствора лекарственного средства «Фламина таблетки» (рис. 3), а также времени удерживания пиков индивидуальных веществ (рис. 4-7, табл. 1) позволило идентифицировать четыре соединения ( 1-4 ), среди которых доминирующим является изосалипурпозид ( 1 ).

Рис. 2. Схема ВЭЖХ-хроматограммы извлечения из цветков бессмертника песчаного (здесь и далее номера пиков веществ соответствуют таковым в таблице 1)

Рис. 3. Схема ВЭЖХ-хроматограммы раствора препарата «Фламина таблетки»

Рис. 4. Схема ВЭЖХ-хроматограммы изосалипурпозида ( 1 )

Рис. 5. Схема ВЭЖХ-хроматограммы салипурпозида ( 2 )

Рис. 6. Схема ВЭЖХ-хроматограммы 5,7-дигидроксифталида ( 3 )

Рис. 7. Схема ВЭЖХ-хроматограммы 5-метокси-7-гидроксифталида ( 4 )

Таблица 1. Время удерживания пиков веществ цветков бессмертника песчаного и препарата «Фламина таблетки» на хроматограммах

Вещество	№ пика на хроматограмме	Время удерживания на хроматограмме, мин
		извлечение из сырья	фламин	вещество
изосалипурпозид ( 1 )	5	7,198	7,953	7,399
салипурпозид ( 2 )	3	3,795	3,926	3,976
5,7-дигидроксифталид ( 3 )	2	2,919	2,975	3,221
5-метокси-7-гидроксифталид ( 4 )	4	4,832	5,184	5,285
вещество неидентифицированное	1	2,215	2,265	-

Методика количественного определения изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки». Около 0,3 г (точная навеска) порошка измельченных таблеток помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 95% спирта, растворяют содержимое колбы при перемешивании в течение 30 мин, доводят объем раствора до метки 95% спиртом и затем фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл (испытуемый раствор). 5 мкл испытуемого раствора вводят в жидкостной хроматограф «Милихром-5» с УФ-детектором. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2 x 80 мм), стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система – ацетонитрил: вода в соотношении 25:75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования – 100 мкл/мин. Проводят УФ-детектирование при длине волны 360 нм, диапазон чувствии-тельности 0,5. Проводят не менее 3 параллельных определений. Параллельно 5 мкл раствора ГСО изосалипурпозида вводят в хроматограф и хроматографируют как описано выше. Проводят определение высоты пика ГСО изосалипурпозида и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам 3-х определений. Определяют время выхода и идентифицируют пик изосалипурпозида на хроматограмме испытуемого раствора. Измеряют высоту пика изосалипурпозида на хроматограмме и рассчитывают среднюю высоту пика по трем параллельным определениям.

Содержание изосалипурпозида в одной таблетке лекарственного средства «Фламина таблетки» в граммах ( X ) вычисляют по формуле:

X = HmV Рср H0mV0V2 ;

где H – среднее значение высоты пика изо-салипурпозида испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца, мм; H о – среднее значение высоты пика раствора ГСО изосалипурпозида, вычисленное из хроматограмм раствора ГСО изосалипурпозида, мм; V – объем испытуемого раствора, мл; V 1 – объем вводимой пробы испытуемого раствора, мкл; V о – объем раствора ГСО изосалипурпозида, мл; V 2 – объем вводимой пробы раствора ГСО изосалипурпозида, мкл; m – масса навески, г; m о – масса ГСО изосалипурпозида, г; Р ср. – средняя масса таблетки, г.

Приготовление раствора изосалипур-позида-стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) изосалипурпозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20-30 мл 95% этилового спирта, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки и перемешивают.

Содержание изосалипурпозида в лекарственном препарате «Фламина таблетки» варьирует в пределах от 10,35 мг до 11,05 мг в одной таблетке.

Метрологические характеристики разработанной методики ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида лекарственного средстве «Фламина таблетки» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,03% (табл. 2). Опыты с добавками ГСО изосалипурпозида к навеске препарата показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики.

Таблица 2. Метрологические характеристики методики количественного определения изосалипурпозида в одной таблетке лекарственного средстве «Фламина таблетки»

f	X	S	P, %	t (P,f)	ΔX	E, %
10	10,35 мг	0,1870	95	2,23	± 0,417	± 4,03

Выводы:

• 1.    С использованием ВЭЖХ-анализа изучен компонентный состав цветков бессмертника песчаного и лекарственного средства «Фламина таблетки» и определено, что в обоих случаях доминирующим флавоноидом являя-ется изосалипурпозид.

• 2.    Разработана методика количественного определения содержания изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» и обоснована целесообразность использования в методике ВЭЖХ-анализа ГСО изосалипурпо-зида.

• 3.    Содержание изосалипурпозида в лекарственном препарате «Фламина таблетки» варьирует от 10,35 мг до 11,05 мг в одной таблетке. Ошибка единичного определения изосалипурпозида в лекарственном средстве «Фламина таблетки» с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,03%.