Перспективы применения ацетилсалициловой кислоты в комбинации с антибактериальными препаратами против ведущих возбудителей остеомиелита

Остеомиелит — тяжелое инфекционно-воспалительное заболевание костной ткани, вызываемое преимущественно бактериальными возбудителями, такими как Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa , и другими патогенами [1–4]. Несмотря на достижения современной антимикробной терапии, лечение пациентов с остеомиелитом остается сложной задачей из-за формирования биоплёнок, устойчивости к антибиотикам и хронизации воспалительного процесса [5–7]. В связи с этим, актуальным направлением является поиск новых стратегий терапии, включающих комбинацию антибактериальных препаратов с адъювантными средствами, способными усиливать их эффективность.

Ацетилсалициловая кислота (АСК) — один из перспективных кандидатов для усиления действия антибактериальных препаратов. Помимо известного противовоспалительного и антиагрегантного действия, аспирин демонстрирует способность модулировать активность антибиотиков, подавлять образование бактериальных биопленок и влиять на иммунный ответ [8–11]. В последние годы появляются данные о его синергизме с некоторыми антибактериальными препаратами в отношении устойчивых штаммов микроорганизмов [12].

Цель работы — оценить in vitro влияние аспирина в комбинации с антибактериальными препаратами на рост микробных культур клинически значимых штаммов бактерий при остеомиелите.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования — клинически значимые штаммы бактерий K. pneumoniae ( n = 12), P. aeruginosa ( n = 12), S. aureus ( n = 12), S. epidermidis ( n = 12), выделенные из ран пациентов c хроническим остеомиелитом.

Исследование биоматериалов, полученных от пациентов, выполняли в соответствии с принятыми международными стандартами (UK SMI). Видовую идентификацию микробных культур проводили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии. Чувствительность бактерий к антимикробным препаратам (K. pneumoniae — к ципрофлоксацину, цефепиму, имипенему, меропенему; P. aeruginosa — к ципрофлоксацину, цефепиму, имипенему, меропенему, амикацину, пиперациллин/тазобактаму; S. aureus и S. epidermidis — к ванкомицину, гентамицину, ципрофлоксацину, эритромицину, цефокситину), включенным в формулярный перечень Центра, определяли согласно критериям EUCAST ( англ .: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Version 9.0, valid from 2019-01-01).

Критерий включения: клинические штаммы в пределах одной таксономической группы, характеризовавшиеся сходной чувствительностью к тестируемым антибактериальным препаратам. В эксперимент вошли только метициллин-чувствительные штаммы стафилококков.

В качестве тест-культур использовали музейные штаммы бактерий, принадлежащих к четырем таксономическим группам: Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Klebsiella pneumoniae АТСС 700603, Staphylococcus aureus АТСС 29213, Staphylococcus epidermidis АТСС 14990.

Эксперимент разделен на четыре серии:

• —    контрольная серия — готовили суспензии исследуемых культур, содержащие 5×10⁶ КОЕ/мл (колониеобразующие единицы) бактерий;

• —    вторая серия (0,03 % АСК, 300 мкг/мл) — во второй части эксперимента по 1 мл АСК вносили в пробирки с культурами, содержащими 5×10⁶ КОЕ/мл бактерий, инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин;

• —    третья серия — полимиксин (5 мг/мл) в случае с грамотрицательными бактериями и гентамицин (40 мг/мл) в случае с грамположительными бактериями инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин совместно с суспензиями, содержащими 5×10⁶ КОЕ/мл микробных клеток;

• —    четвертая серия — суспензии бактерий (5×10⁶ КОЕ/мл) инкубировали с комбинацией АСК (0,05 %) с антибиотиками (полимиксином или гентамицином) в течение 30 мин.

Полимиксин обладает активностью против устойчивых грамотрицательных бактерий (P. aeruginosa , A. baumannii , K. pneumoniae , E. coli ), является препаратом выбора для лечения инфекций, вызванных бактериями с резистентностью к карбапенемам. Полимиксины действуют путем разрушения внешней мембраны грамотрицательных бактерий (выступая в роли детергента). Гентамицин обладает высокой бактерицидной активностью в отношении стафилококков.

Для получения газона микробные взвеси в каждой серии эксперимента с помощью ватного тампона наносили на поверхность агара Мюллера – Хинтон, на поверхность которого помещали диски с ан- тибиотиками и инкубировали в течение суток в термостате при 37°. Одновременно делали высевы на агар Шедлера с бараньей кровью (с гемином и витамином К1) для учета роста микробных клеток. Результаты оценивали через сутки.

Антибактериальное действие оценивали по отсутствию зоны роста бактерий вокруг дисков.

Все эксперименты проводили в трёх повторах, данные представлены в виде среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD). Статистические тесты выполнены в программе Gnumeric 1.12.17. Cравнение групп проводили с помощью критерия Стьюдента после предварительного определения типа распределения в выборках с помощью критерия Андерсона – Дарлинга. Порог значимости для всех тестов составлял р < 0,05.

Работа выполнена в формате in vitro исследования без участия животных или человека.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При совместной инкубации АСК (0,05 %) с грамотрицательными бактериями (K. pneumoniae , P. aeruginosa ) на чашках Петри отсутствовал рост микроорганизмов. В случае с бактериями S. aureus количество КОЕ было снижено в сравнении с контрольной группой. На чашках с S. epidermidis рост отсутствовал (рис. 1).

Грамотрицательные бактерии (Р. aeruginosa, К. pneumoniae')

Грамположительные бактерии (S. aureus, S. epidermidis)

Рис. 1. Влияние АСК на рост бактерий P. aeruginosa , K. pneumoniae , S. aureus , S. epidermidis . На чашках справа — контрольная серия, слева — с АСК

При совместной инкубации полимиксина с P. aeruginosa на чашках Петри регистрировали незначительный рост бактерий, в случае с K. pneumoniae наблюдали лишь отдельные колонии. При инкубации совместно с полимиксином и АСК (0,03 %) на чашках с K. pneumoniae роста микроорганизмов не было, на чашках с P. aeruginosa отмечали незначительный рост. Гентамицин подавлял рост бактерий S. aureus (на чашках отмечали незначительное количество бактерий). АСК (0,03 %) усиливал бактерицидные свойства гентамицина (на чашках отсутствовал рост бактерий) (рис. 2).

Рис. 2. Влияние АСК на рост микробных культур K. pneumoniae , P. aeruginosa , S. aureus на кровяном агаре после инкубации с антибиотиком и комбинации антибиотика с АСК: а, в — полимиксин (5 мг/мл); б, г — полимиксин (5 мг/мл) + АСК (0,03 %); д — гентамицин (40 мг/мл); е — гентамицин (40 мг/мл) + АСК (0,03 %)

Также наблюдали различия в зонах задержки роста бактерий при постановке антибиотикочувстви-тельности в зависимости от концентрации АСК (рис. 3, б, в). Для штаммов K. pneumomiae при использовании АСК (0,03 %) зоны задержки роста бактерий не отличались от контрольной группы, однако число жизнеспособных клеток на поверхности агара было ниже (рис. 3, д).

a - музейный штамм К. pneumoniae

б - музейный штамм Р. aeruginosa

В группе с АСК значимые различия в зонах задержки роста наблюдали для клиндамицина и цефок-ситина в сравнении с контрольной серией для клинических штаммов S. aureus (табл. 1). Для штаммов S. epidermidis отмечены отличия в зоне задержки роста бактерий для клиндамицина (табл. 2). На чашках с P. aeruginosa значимые изменения в зонах задержки роста наблюдали для имипенема, меропенема, цефепима и ципрфлоксацина (табл. 3).

Таблица 1

Таблица 2

Диаметр зоны задержки роста бактерий S. aureus Диаметр зоны задержки роста бактерий S. epidermidis

Препарат (мкг)	Диаметр зоны задержки роста бактерий S. aureus , мм
	контрольная серия, n = 12	АСК (0,05 %), n = 12
Клиндамицин (2)	25 ± 2	32 ± 2*
Цефокситин (30)	29 ± 3	33 ± 2*
Ванкомицин (5)	19 ± 1	19 ± 1
Гентамицин (30)	23 ± 2	24 ± 2
Ципрофлоксацин (5)	25 ± 3	25 ± 2
Эритромицин (15)	26 ± 2	28 ± 3

Препарат (мкг)	Диаметр зоны задержки роста бактерий S. epidermidis , мм
	контрольная серия, n = 12	АСК(0,05 %), n = 12
Клиндамицин (2)	24 ± 2	29 ± 2*
Цефокситин (30)	25 ± 2	26 ± 2
Ванкомицин (5)	19 ± 1	19 ± 1
Гентамицин (30)	25 ± 3	24 ± 2
Ципрофлоксацин (5)	26 ± 2	25 ± 2
Эритромицин (15)	25 ± 2	27 ± 2

Примечание : n — число штаммов, * — уровень значимости различий между контрольной серией и опытной с АСК, p < 0,05.

Таблица 3

Зона задержки роста бактерий P. aeruginosa

Антибактериальный препарат (мкг)	Зона задержки роста бактерий P. aeruginosa , мм
	контрольная серия, n = 12	АСК (0,05 %), n = 12
Имипенем (10)	24 ± 3	30 ± 2*
Меропенем (10)	29 ± 2	33 ± 1*
Цефепим (30)	28 ± 3	32 ± 2*
Пиперациллин/тазобактам (30/6)	26 ± 2	26 ± 3
Амикацин (30)	22 ± 2	25 ± 2
Ципрофлоксацин (5)	28 ± 2	33 ± 2*

Примечание : n — число штаммов, * — уровень значимости различий между контрольной серией и опытной с АСК, p < 0,05.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) традиционно применяют в качестве противовоспалительных, болеутоляющих и жаропонижающих препаратов. Вместе с тем, имеются данные о воздействия НПВС на бактерии и связанные с ними инфекции [13]. Данные об активности НПВП in vitro против планктонных бактерий и биоплёнок на сегодняшний день противоречивы [14–17].

Один из представителей НПВС — ацетилсалициловая кислота, являющаяся синтетическим производным салициловой кислоты. Действие АСК — комплексное, зависит от дозировки. Противовоспалительное, жаропонижающее и обезболивающее (используются средние/высокие дозы ~ 500–1000 мг) действия реализуются через ингибирование ферментов циклооксигеназ (ЦОГ-1 и ЦОГ-2), которые участвуют в синтезе простагландинов, — веществ, вызывающих боль и отек при воспалении; антиагрегантное (используются низкие дозы ~ 75–100 мг.) действие реализуется через блокаду ЦОГ-1 в тромбоцитах.

В разных исследованиях приведены данные о влиянии АСК на тромбоциты после воздействия бактериями (Staphylococcus aureus , Enterococcus faecalis , Streptococcus pyogenes , Escherichia coli ) [18, 19]. Показано, что клинические штаммы S. aureus могут вызывать активацию тромбоцитов, экспрессию маркеров клеточной гибели и высвобождение факторов воспаления [18, 19]. Ацетилсалициловая кислота ограничивает воздействие S. aureus на тромбоциты, снижая темпы гибели клеток, восстанавливает их количество и уменьшая вклад тромбоцитов в воспаление, связанное с присутствием в крови бактериальных патогенов.

В настоящее время изучают способность аспирина оказывать влияние на образование биопленок микроорганизмами; проявлять синергизм с антибиотиками, повышая проницаемость клеточных стенок бактерий и делая их более уязвимыми; модулировать иммунный ответ организма [8–12]. L.I. Kupferwasser et al. сделали вывод об усилении чувствительности MRSA к ß-лактамным антибиотикам в присутствии аспирина [9]. В другой работе показано усиление активности ванкомицина против устойчивых энтерококков в присутствии аспирина [20]. В ряде исследований приводятся данные о бактериостатическом действии АСК на грамположительные бактерии и отсутствие эффекта при воздействии на грамотрицательные бактерии [13]. S.A. El-Mowafy et al. при исследовании QS-ингибирующее действия АСК на P. aeruginosa наблюдали снижение подвижности бактерий [21]. В другом исследовании показали, что воздействие АСК в течение 1,5 часов приводило к удалению 30 % биоплёнок, образованных S. Epidermidis и P. aeruginosa на полистироле [22].

В литературе имеются данные, свидетельствующие о формировании устойчивых популяций бактерий после воздействия НПВП, в том числе и АСК [14, 23].

В нашем исследовании отсутствие роста на чашке c бактериями S. epidermidis в присутствии АСК, даже без антибиотиков, позволяет предположить, что одним из механизмов действия может быть подавление адгезии и формирования биоплёнки [24]. Наличие выраженного эффекта АСК в отношении грамотрицательных бактерий (K. pneumoniae , P. aeruginosa ) может быть связано с его воздействием на наружную мембрану микробных клеток, в то время как на грамположительные бактерии (S. aureus ) препарат оказывал меньшее влияние, лишь снижая метаболическую активность. Аспирин, будучи слабой кислотой, также может нарушать целостность мембран и повышать их проницаемость [8].

Наши результаты позволяют предположить, что АСК усиливает действие полимиксина. Усиление бактерицидного действия гентамицина в присутствии АСК на S. aureus может быть связано со способностью салицилатов подавлять синтез белка и нарушать энергетический метаболизм бактерий, что повышает эффективность накопления аминогликозидов внутри клетки [13].

Данное исследование носит больше описательный характер. В перспективе планируется определение индексов МИК (минимальная ингибирующая концентрация) и FIC (фракционная ингибирующая концентрация) для подтверждения синергизма, изучение влияния АСК на зрелые биоплёнки и оценка эффективности комбинации на соответствующих in vivo моделях остеомиелита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование продемонстрировало, что ацетилсалициловая кислота in vitro проявляет синергизм с рядом антибиотиков, значительно усиливая их бактерицидную активность в отношении клинических изолятов, ассоциированных с остеомиелитом.