Перспективы применения стволовых клеток в ветеринарии

Введение. Актуальность изучения стволовых клеток обусловлена их широким применением в медицине. Наиболее часто стволовые клетки используются в качестве трансплантатов при различных заболеваниях. Термин «стволовая клетка» Максимов А.А. предложил еще в 1908 году, чтобы объяснить механизм быстрого самообновления клеток крови. Каждые сутки в крови погибают несколько миллиардов клеток, а им на смену приходят новые популяции эритроцитов, лейкоцитов и лимфоцитов. Максимов А.А. первый догадался, что обновление клеток крови – это особая технология, отличная от простых клеточных делений. Если бы клетки крови самообновлялись простым клеточным делением, это потребовало бы гигантских размеров костного мозга.

Основная часть. Стволовые клетки – это так называемые «незрелые» или недифференцированные клетки, которые есть в организме каждого живого многоклеточного существа. Стволовые клетки не имеют специализации, то есть, способны при определенных условиях делиться и превращаться практически в любой вид взрослой ткани – в скелетные мышцы, нейроны, ткани печени и т.д. Открытие, грозящее революцией традиционной медицине, заключается в обнаружении общего принципа регенерации взрослых тканей. То есть, организм любого млекопитающего, в том числе, человека, снабжен определенным «запасом» стволовых клеток. Их главные особенности – возможность самообновляться и образовывать новые такие же клетки, делиться, а также принимать функции любых тканей и органов (это называется дифференциацией клеток). Впервые термин «стволовая клетка» стали использовать в 1909 году. Роль этих клеток изучали ученые во многих странах мира в течение практически всего ХХ века, постоянно дополняя знания о роли стволовых клеток в организме и возможностях их использования. Также применяется термин «аутологичные» (собственные) стволовые клетки.

Из стволовых клеток в период внутриутробного развития формируются все внутренние органы, сосуды, кожа, все остальные ткани. Так как процесс дифференциации клеток происходит до рождения, наибольшее количество стволовых клеток содержит именно развивающийся организм, а к моменту появления на свет больше всего стволовых клеток сохраняется в пуповинной крови, ткани пуповины и плаценте.

В организме взрослого человека тоже есть стволовые клетки. Это своего рода «ремкомплект», которые организм использует для того, чтобы помочь восстановлению и обновлению органов и тканей. Но чем старше человек, тем стволовых клеток меньше, и тем меньше возможностей «починить» пострадавший орган. Снижение количества стволовых клеток и замедление их производства организмом – естественный процесс, являющийся частью процесса физического старения.

Стволовые клетки бывают разными в зависимости от происхождения, то есть – в зависимости от того, из какого исходного материала их получают. Кроме эмбриональных и фетальных стволовых клеток, получение которых имеет серьезные этические ограничения, существует также возможность выделения «незрелых» клеток без какого-либо вреда для организма, не противоречащая моральным и этическим нормам. К полученным таким образом стволовым клеткам относятся:

• •    Постнатальные («взрослые») стволовые клетки. Это клетки взрослого организма, которые, как уже было сказано, содержатся и производятся в нем в небольшом количестве. Проблема в том, что такие клетки часто находятся на определенной стадии дифференцировки, а это значительно сужает возможности их применения. Однако есть и преимущества: можно получить аутологичные постнатальные стволовые клетки, а это означает, что реципиент не будет их отторгать после трансплантации, так как это его собственный биологический материал.

• •    Стволовые клетки пуповинной крови. Относятся к постнатальным стволовым клеткам, но из всех клеток взрослого, зрелого организма они в наименьшей степени дифференцированы. Это означает, что в случае необходимости их можно использовать при широком спектре заболеваний, в геронтологии, восстановительной медицине, ведь они имеют наибольший «ремонтный» потенциал, дифференцируясь в клетки тех органов или тканей, которые необходимо «починить».

В зависимости от «задач», которые могут выполнять незрелые клетки организма, их разделяют на три вида:

• •    Гемопоэтические стволовые клетки называются также кроветворными, так как они дифференцируются в клетки крови. Они содержатся как в пуповинной крови, так и в костном мозге – именно их часто используют для трансплантации при злокачественных заболеваниях крови.

• •    Мезенхимальные стволовые клетки называют стромальными и мультипотентными. Их особенность заключается в способности дифференцироваться в клетки костной, хрящевой и жировой ткани. Эти клетки выделяют из пуповинной крови, пупочного канатика, плаценты. Они активно используются в терапии диабетической стопы (тяжелого осложнения сахарного диабета, при восстановлении кожных покровов), а также заболеваний опорно-двигательного аппарата, в частности – суставов.

• •    Тканеспецифичные клетки являются прогениторными, то есть, «клетками-предшественницами». Они содержатся в органах и тканях, организм задействует их при необходимости обновления клеточной массы того или иного органа или ткани. В отличие от других недифференцированных стволовых клеток, которые могут делиться неограниченное количество раз, тканеспецифичные клетки такой способности не имеют.

В терапевтических целях используют гемопоэтические и мезенхимальные стволовые клетки, чаще всего – выделенные из пуповинной крови, пупочного канатика и плаценты.

Тотипотентные стволовые клетки (ТСК): клетки, формирующие целый организм и все известные типы клеток (около 300 типов). Истинной ТСК является оплодотворенная яйцеклетка, а в эмбриогенезе – клетки 2-8-клеточного бластомера, по некоторым данным – бластоцисты до размера 8-32 клетки (3-5 клеточных делений). Программа тотипотентности существует в ооците, зиготе и бластомерах. 2)

плюрипотентные (до 11 дня после оплодотворения - гаструляция, период имплантации зародыша в стенку матки): клетки эмбриона и внезародышевых оболочек. Способны образовывать практически все известные типы тканей.

Полипотентные стволовые клетки (ПСК) – образуют несколько типов клеток в пределах одного вида ткани. Пример: полипотентная стволовая кроветворная клетка (ПСКК) дает начало всем клеткам крови (эритроциты, все виды лейкоцитов, тромбоциты).

Унипотентные клетки, дающие начало только одному типу клеток.

Клетки развивающегося эмбриона изначально тотипотентны, но теряют это свойство после нескольких клеточных делений, т.е. онидифференцируются. Некоторые из клеток организма, не дифференцируются окончательно, а становятся плюрипотентными, т.е. способны давать лишь некоторые типы клеток целого организма. Тотипотентные клетки эмбриона называют так же – эмбриональные стволовые клетки (ESC), а плюри- и мультипотентные клетки организма называют взрослыми стволовыми клетками. Функция первых в организме очевидна, из одной клетки должен развиться целый организм с огромным числом клеточных типов (~200 у человека), каждый из которых выполняет свою функцию. Взрослые стволовые клетки необходимы организму для восполнения погибших клеток в процессе жизни. Взрослые стволовые клетки способны заменять практически все ткани в организме: мозг, костный мозг, кровь, почку, эпителий пищеварительной системы, кожу, сетчатку, мышцы, поджелудочную железу и печень.

Взрослые стволовые клетки способны к самоподдержанию и производству клеток-предшественников, которые затем дифференцируются.

В настоящее время терапия стволовыми клетками у ветеринарных пациентов не контролируется строго регулирующими органами ни в одной стране. К сожалению, это привело к внедрению некоторых методов лечения, которые не продемонстрировали эффективности in vitro или в доклинических исследованиях на животных. В целом, терапевтическая роль стволовых клеток в регенеративной медицине до конца не изучена. Неясно, функционируют ли стволовые клетки в конечном итоге после дифференцировки в тканеспецифичную клетку, такую как теноцит, или они в первую очередь улучшают восстановление тканей за счет секреции иммуномодулирующих и биоактивных трофических факторов, или происходит комбинация двух механизмов. Эти вопросы не носят чисто академического характера, потому что, если стволовые клетки действительно иммуномодулируют, тогда аллогенные трансплантации должны быть возможны. Безопасное и эффективное применение аллогенных стволовых клеток подразумевает возможность разработки готовых продуктов из стволовых клеток для повышения доступности и быстрого внедрения методов лечения стволовыми клетками на ранних стадиях заболевания. Потенциал того, что аллогенные стволовые клетки будут более рентабельными, чем аутогенные стволовые клетки, сомнителен. Для аллогенных клеток не было бы никаких затрат, связанных с процедурой сбора ткани, но были бы дополнительные расходы на обеспечение того, чтобы продукт из стволовых клеток не вызывал заболеваний, и на хранение стволовых клеток до продажи.

Продукты из стволовых клеток в клиническом применении.

У ветеринарных пациентов в настоящее время используются три подхода на основе MSC для лечения повреждений сухожилий, связок или хрящей / суставов у лошадей или собак. Как указывалось ранее, существуют основанные на исследованиях, но не клинические отчеты, которые документируют использование стволовых клеток для улучшения заживления переломов, а также нет никаких сообщений о сердечно-сосудистых, желудочно-кишечных или нейроэндокринных системах организма. Первый метод на основе МСК основан на выращенной в культуре клеточной популяции, полученной из аспирата костного мозга, второй представляет собой другой подход на основе аспирата костного мозга с использованием концентрированной смешанной клеточной популяции, полученной из аспирации костного мозга, и третий метод использует смешанную популяцию ядросодержащих клеток, полученную из жировой ткани. Каждая техника имеет свои сильные и слабые стороны. Эмбриональные стволовые (ES) клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые (iPS) клетки и клетки, полученные из пуповинной крови, также начинают исследоваться в лаборатории, но еще не были применены к клиническому сценарию.

Выращенные в культуре мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (БМ-МСК) обладают преимуществами легкого и относительно неинвазивного получения и обладают большей способностью дифференцироваться в типы тканей опорно-двигательного аппарата по сравнению с другими МСК. Более того, БМ-МСК получили наибольшее научное внимание и, следовательно, являются наиболее охарактеризованными. Одним из недостатков культивируемых БМ-МСК является задержка во времени от 3 до 6 недель с момента аспирации костного мозга до начала лечения. Этот временной лаг обусловлен временем, необходимым для выращивания МСК. Костный мозг собирают из грудины или тазобедренных суставов лошадей под седативным воздействием или могут собирать во время операции, если лошадь уже находится под наркозом. У лошади семь костномозговых полостей в грудине, и костномозговые полости 3-5 являются самыми большими (до 5 см в диаметре). Ультразвуковое исследование может быть использовано для выделения пространства костного мозга, но в этом нет необходимости, если вы знакомы с региональной анатомией. Костный мозг обычно аспирируется из проксимального отдела плечевой кости, проксимального отдела бедренной кости или тазобедренного сустава у собак.

Тендинит

Использование выращенных в культуре БМ-МСК для лечения повреждений сухожилий подтверждается экспериментальными исследованиями на лошадях и лабораторных животных, которым МСК были имплантированы при хирургических или вызванных коллагеназой повреждениях сухожилий. Эти исследования показали благоприятное влияние на организацию тканей, состав и механику сухожилий и связок, имплантированных МСК. Эти исследования различаются по плану эксперимента в отношении количества имплантированных BM-MSC (от 0,5 до 10 х 106), носителя для суспензии (плазма, фосфатно-буферный физиологический раствор, супернатант костного мозга) и времени после травмы до инъекции (до 2 недель). Впервые о клиническом применении BM-MSC было сообщено в 2003 году. Совсем недавно небольшое исследование случай-контроль (n = 11) продемонстрировало, что в результате BM-MSC 90% обработанных лошадей успешно вернулись к спортивной функции до травмы, а скаковые лошади не получили повторного повреждения поверхностного сухожилия сгибателя пальцев через 2 года, тогда как все лошади контрольная популяция пострадала от повторной травмы. Годвин и Смит сообщили о 141 лошади, получавшей культивированные BM-MSC, с наблюдением не менее 3 лет. Авторы сообщили о значительном снижении частоты повторных травм у скаковых лошадей National Hunt, но не у чистокровных скаковых лошадей, получавших BM-MSC, по сравнению с контрольными лошадьми, получавшими традиционное лечение (от 23% до 66%). На сегодняшний день доклинические и клинические исследования были сосредоточены на способности стволовых клеток усиливать регенерацию тканей и не исследовали потенциальную иммуномодулирующую роль стволовых клеток для восстановления сухожилий. Скорее всего, это просто вопрос времени, поскольку концепция иммуномодуляции появилась более недавно, чем более традиционная парадигма дифференцировки и функционирования стволовых клеток как тканеспецифичных клеток. Хотя вышеупомянутые исследования в разной степени подтвердили стволовость клеток, образование опухоли, эктопической кости или хряща не наблюдалось ни в клинических, ни в исследовательских исследованиях.

Повреждение хряща / остеоартрит

Выращенные в культуре BM-MSC были оценены на модели острого повреждения хряща у лошадей, при котором на латеральном вертельном гребне бедренной кости были созданы дефекты суставного хряща диаметром 15 мм во всю толщину. BM-МСК были имплантированы в аутогенный фибрин в качестве каркаса в одной конечности, а в противоположную конечность был привит только аутогенный фибрин. При повторной артроскопии на 30-й день результаты артроскопии и биопсии поражений BM-MSC были значительно лучше, чем контрольные трансплантаты, содержащие только фибрин. Однако через 8 месяцев не наблюдалось существенных различий между двумя группами по гистологическому или биохимическому составу. На лошадиной модели раннего остеоартрита (ОА) было проведено прямое сравнение между BM-MSC и клетками стромальной сосудистой фракции (AD-SVF), полученными из жировой ткани. Два препарата стволовых клеток вводили непосредственно в пораженные суставы через 14 дней после индукции ОА. Суставы, обработанные BM-MSC, показали значительно меньший синовиальный выпот и значительно более низкие концентрации простагландина E2 (PGE2) по сравнению с суставами, обработанными клетками AD-SVF. Никаких различий в биохимии или гистологии хряща, анализе синовиальной жидкости или других клинических параметрах не наблюдалось. Интересно отметить, что концентрация PGE2 в синовиальной жидкости, хотя и не исследовалась непосредственно в исследовании, была снижена при лечении BM-MSC, потому что PGE2 является одним из механизмов, с помощью которого BM-MSC модулируют иммунные клетки и оказывают противовоспалительное / иммуномодулирующее действие, такое как подавление пролиферации лимфоцитов и активации Т-клеток. Несколько других доклинических исследований на моделях ОА с использованием коз, овец, кроликов и крыс продемонстрировали способность BM-MSC усиливать регенерацию хряща и даже мениска. В совокупности эти исследования показывают, что БМ-МСК выполняют двойную функцию в суставной среде: модулируют местный иммунологический ответ, опосредованный Т-клетками, и усиливают регенерацию тканей. Необходимы долгосрочные исследования с использованием BM-MSC при естественных повреждениях суставного хряща у ветеринаров и людей, чтобы продемонстрировать восстановление функции сустава, уменьшение суставной боли и долговечность терапии на основе BM-MSC.

Концентрат костного мозга

Концентрированный аспират костного мозга был разработан для увеличения концентрации стволовых клеток по сравнению с первичным аспиратом костного мозга и для того, чтобы избежать задержки от постановки диагноза до лечения при использовании расширенных в культуре BM-MSC. В дополнение к концентрации стволовых клеток повышается концентрация тромбоцитов и, следовательно, анаболических факторов роста. При соединении с тромбином фибриноген, присутствующий в BMC, превращается в фибрин, и образуется твердый каркас для удержания клеток и факторов роста в заданном месте.

Повреждение хряща / остеоартрит

В модели острого повреждения хряща у лошадей, рассмотренной выше (повреждения диаметром 15 мм), одна конечность была обработана BMC и микроразрывом, а другая была обработана только микроразрывом. Повторная артроскопия через 3 месяца продемонстрировала значительно улучшенную репарацию ткани в дефектах, привитых BMC, по сравнению с тканью с микроразрывами с увеличенным объемом и большей интеграцией репаративной ткани с окружающим хрящом хозяина. Через 8 месяцев все данные макроскопической, гистологической и магнитно-резонансной томографии показали устойчивое улучшение восстановительной ткани, пересаженной BMC, по сравнению с микроразрывом. Как и многие другие технологии на основе стволовых клеток, BMC применяется в клинических ветеринарных и человеческих пациентов, но рецензируемые результаты не были опубликованы.

Клетки стромальной фракции сосудов, полученные из жировой ткани.

В доступной в настоящее время методике используется смесь клеток, полученных из жировой ткани, хирургически вырезанной у лошадей или собак. Клетки AD-SVF просто выделяются и вводятся пациенту без стадии культивирования клеток. По сравнению с культивируемыми BM-MSC, этот метод имеет преимущество в поставке клеток за короткий период времени (48 часов), и следует помнить, что, хотя существует большое количество ядросодержащих клеток, полученных из жировой ткани, только небольшой процент ядросодержащих клеток являются стволовыми клетками. У людей от 0,7% до 5% ядросодержащих клеток во фракции стромальных сосудов являются стволовыми клетками.

Тендинит

В настоящее время нет ссылок на клиническое применение клеток AD-SVF при тендините лошадей. Результаты пилотного исследования продемонстрировали значительное улучшение гистологического показателя в сухожилиях, обработанных клетками AD-SVF, по сравнению с контрольными сухожилиями, обработанными фосфатным буфером солевым раствором. Хотя клетки AD-SVF доступны уже почти 8 лет и использовались для лечения нескольких тысяч лошадей, не было опубликовано никаких отчетов, документирующих их использование в клинических случаях тендинита лошадей. клеткиAD-SVF-клетки в настоящее время не одобрены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США для применения у людей.

Повреждение хряща / остеоартрит

Как упоминалось выше, применение клеток AD-SVF в лошадиной модели раннего ОА не привело к какому-либо заметному улучшению здоровья суставов. Фактически, клетки AD-SVF приводили к увеличению концентрации в синовиальной жидкости провоспалительного цитокинового фактора некроза опухоли-альфа. У собак было опубликовано два сообщения об улучшении клинических признаков ОА после лечения. В двойном слепом исследовании, оценивающем использование клеток AD-SVF в тазобедренном суставе собак, ветеринары (но не владельцы собак) сообщили о признаках клинического улучшения. Во втором неконтролируемом исследовании с использованием клеток AD-SVF для лечения ОА локтевого сустава ветеринары и, в меньшей степени, владельцы сообщили об улучшении клинических признаков. Несоответствие клинических преимуществ, отмеченных владельцами в этих исследованиях, посвященных использованию клеток AD-SVF при ОА, неясно, но, возможно, предполагает, что какую-либо пользу от применения клеток AD-SVF можно увидеть только в более запущенных случаях ОА или что изменения хромоты, связанные с ОА локтевого сустава, по сравнению с таковыми при ОА локтевого сустава. ОА тазобедренного сустава легче воспринимается владельцами.