Первичный скрининг бактериальных штаммов антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фомоза подсолнечника (часть 2)

Введение. Подсолнечнику, основной масличной культуре нашей страны, значительный ущерб наносит комплекс болезней. Все большую вредоносность на культуре в России показывает фомоз, или черная пятнистость ( Phoma macdonaldii Boerema) [1; 2].

В последние годы большое внимание уделяется разработке экологически безопасных мер борьбы с вредителями и болезнями. В связи с этим разработка биотехнологий получения и применения современных конкурентоспособных микробиологических препаратов для сельского хозяйства приобретает первостепенное значение. Одним из немногих в России разработчиков микробиопрепаратов для защиты растений от болезней является лаборатория биометода ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК. В результате многолетних исследований создана коллекция перспективных штаммов грибов и бактерий антагонистов широкого круга патогенов, поражающих масличные и другие сельскохозяйственные культуры. Разработан ряд экологически безопасных микробиопрепаратов, полифункционального типа действия (Вермикулен, Хетомин, Бацил-лин, Веррукозин, Фуникулозум и др.), технологии производства разных препаративных форм и их применения против комплекса патогенов на подсолнечнике, сое, рапсе, а также яблоне, землянике, винограде и других сельскохозяйственных культурах [3; 4; 5; 6; 7; 8; 9]. В настоящее время проводятся исследования по разработке микробиологических средств снижения вредоносности фомоза подсолнечника.

В нашей стране зарегистрированных микробиопрепаратов против фомоза на подсолнечнике нет. Мы не обнаружили в литературе сведений о разработке биологических мер борьбы с Phoma macdonaldii , кроме испытаний биопрепаратов против фомоза на чае [10]. Поэтому целью наших исследований было проведение ступенчатого скрининга штаммов-антагонистов из коллекции лаборатории биометода ВНИИМК к возбудителю фо-моза подсолнечника.

В настоящей статье представлены результаты первичного скрининга коллекционных штаммов бактерий из родов Bacillus и Pseudomonas к Phoma macdonaldii на трех питательных средах.

Материалы и методы. Агрессивный изолят возбудителя фомоза Phoma macdonaldii выделен нами из стеблей пораженного подсолнечника на посевах ВНИИМК. Агрессивность изолятов возбудителя фомоза определяли методом «агаровых блоков», разработанным В.Ф. Зайчук (1983 г.) [11].

Первичный скрининг бактериальных штаммов антагонистов из коллекции лаборатории биометода к возбудителю фо-моза на подсолнечнике проводили к наиболее агрессивному изоляту методом двойных или встречных культур in vitro [12]. Культуры антагонистов и возбудителя болезни выращивали отдельно в течение пяти суток на агаризированной питательной среде. Стерильным сверлом вырезали блоки с мицелием антагониста и патогена и помещали в одну чашку Петри на расстоянии 6 см. Контролем служили культуры антагонистов и пато- гена, посеянные порознь. Контроль роста культур проводили ежедневно, учеты – на двадцатые сутки культивирования. Отмечали рост патогена и антагониста в процентах от площади чашки Петри (конкуренцию за площадь питания). Для этого измеряли площадь зарастания поверхности питательной среды в см2, а затем проводили перерасчет на процент по пропорции, имея ввиду площадь чашки Петри 81,0 см2. Кроме того, отмечали наличие или отсутствие зон задержки роста патогена в результате синтеза гидролитических ферментов или веществ антибиотической природы (диаметр стерильной зоны, мм), а также нарастание антагониста на колонию патогена (площадь гиперпаразитической зоны, см2). Антагонистов и патоген выращивали на агаризирован-ных средах: картофельно-сахарозной (КСА) [13], овсяной (ОА) [14], а также на специализированных средах: для бактерий из рода Bacillus – Тайлона-3 [13], из рода Pseudomonas – Кинга В [15].

Результаты и обсуждение. Результаты оценки антагонистической активности штаммов бактерий из рода Bacillus к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii на трех питательных средах (КСА, Тайлона-3 и ОА) показали, что механизм действия представлен двумя типами:

• -    антагонист образует стерильную зону задержки роста мицелия патогена (антибиоз);

• -    антагонист занимает значительную поверхность питательной среды (до 50,0 %) и не образует стерильную зону задержки роста патогена (конкуренция за площадь питания).

На картофельно-сахарозном агаре в контроле за 20 суток культивирования изолят Phoma macdonaldii занял 100 % поверхности питательной среды. Из 27 коллекционных штаммов бактерий рода Bacillus антагонистическую активность к патогену через 20 суток совместного культивирования на КСА проявили 22 штамма. Из них только два штамма

(Б (2-1) B. licheniformis и 11-2 Bacillus sp.) показали зарастание поверхности пи-та°тельной среды до 50 %, без образования стерильной зоны (табл. 1).

Таблица 1

Антагонистическая активность штаммов бактерий из рода Bacillus к возбудителю фо-моза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 °С на 20-е сутки культивирования на картофельно-сахарозном агаре г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер стерильной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Phoma macdonaldii	-	100,0	-
Б (2-1) B. licheniformis	50,0	29,6	0
11-2 Bacillus sp.	37,0	4,0	0
Far 8 Bacillus sp.	37,9	30,0	4,0
Fa 4-2 Bacillus sp.	36,1	55,3	4,0
D 7-3 Bacillus sp.	32,9	56,3	5,0
D 7-1 B. subtilis	30,9	38,2	5,0
D-10 Bacillus sp.	16,9	46,3	4,5
5-3 Bacillus sp.	14,9	52,9	3,5
01 кор f Bacillus sp.	14,4	56,1	4,5
Fa 4-1 B. subtilis	14,3	46,3	5,0
Б-12 B. licheniformis	14,1	65,7	4,5
K 1-1 B. subtilis	13,6	58,4	6,5
Fz 9 Bacillus sp.	12,2	65,5	4,0
D 1-3 Bacillus sp .	11,6	55,6	1,0
5Б-1 B. subtilis	8,3	56,7	6,0
D 1-1 Bacillus sp.	6,1	44,6	6,0
11-1 Bacillus sp.	8,2	47,1	13,5
Б-5 B. licheniformis	5,6	47,4	9,0
K 1-2 Bacillus sp.	5,3	52,8	13,0
11-3 Bacillus sp.	2,7	64,2	21,0
3-3 Bacillus sp.	2,7	63,6	11,5
3-2 Bacillus sp.	1,2	78,9	9,5

Остальные 20 штаммов бактерий при зарастании поверхности среды 1,2–37,9 % образовали стерильную зону 1,0–21,0 мм. Следует подчеркнуть, что с уменьшением площади зарастания поверхности питательной среды бактериальные штаммы образовывали большую стерильную зону. Максимальную антибиотическую активность к Phoma macdonaldii на КСА проявил штамм 11-3 Bacillus sp. , у которого стерильная зона составила 21,0 мм (рис 1.1).

На специализированной для бактерий рода Bacillus среде Тайлона-3 в контроле возбудитель фомоза за 20 суток культивирования занял 100 % поверхности питательной среды. Из 27 коллекционных бактерий рода Bacillus антагонистическую активность к возбудителю фомоза 109

через 20 суток совместного культивирования на среде Тайлона-3 проявили 20 штаммов (табл. 2).

Таблица 2

Антагонистическая активность штаммов бактерий из рода Bacillus к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 ^°С на 20-е сутки культивирования на среде Тайлона - 3

г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер стерильной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Phoma macdonaldii	-	100,0	-
Б-4 B. circulans	3,3	38,2	17,0
1а B. polymyxa	1,5	48,4	17,0
D 7-3 Bacillus sp.	10,3	42,9	15,5
3-2 Bacillus sp.	1,2	55,6	13,0
D-10 Bacillus sp.	20,5	34,5	12,0
11-1 Bacillus sp.	23,7	32,1	11,0
11-3 Bacillus sp.	2,6	57,8	10,0
Б-12 B. licheniformis	13,2	25,0	10,0
D 1-3 Bacillus sp.	9,4	50,0	10,0
5-3 Bacillus sp .	17,5	28,9	8,0
Б-5 B. licheniformis	15,4	52,2	8,0
3-3 Bacillus sp.	10,5	38,9	8,0
D 7-1 B. subtilis	8,3	58,3	6,5
Б (2-1) B. licheniformis	13,0	29,6	5,0
11-2 Bacillus sp.	28,1	39,5	5,0
K 1-1 B. subtilis	33,1	34,6	5,0
5Б-1 B. subtilis	29,2	34,5	5,0
Fa 4-1 B. subtilis	28,1	29,4	4,5
Fa 4-2 Bacillus sp.	6,2	56,1	3,0
D 1-1 Bacillus sp.	10,9	59,8	3,0

На среде Тайлона-3 прослеживается та же тенденция, что и на КСА, с уменьшением поверхности зарастания питательной среды бактериальные штаммы образовывали больший размер стерильной зоны. Максимальную стерильную зону (13,0–17,0 мм) образовали штаммы бактерий (3-2 и D 7-3 Bacillus sp., 1а B. polymyxa и Б-4 B. circulans ), занимавших в двойных культурах с возбудителем фо-моза небольшую поверхность питательной среды (1,2–10,3 %). Тогда как группа штаммов бактерий (Fa 4-1, 5Б-1, K 1-1 B. subtilis и 11-2 Bacillus sp.) , занимавшая более значительную поверхность зарастания среды (28,1–33,1 %), образовывала меньшую стерильную зону (4,5–5,0 мм). Максимальная антибиотическая активность к Phoma macdonaldii на среде Тай-лона-3 установлена у штаммов Б-4 B. 110

circulans и 1а B. polymyxa , у которых стерильная зона составила 17,0 мм (рис. 1.2).

11-3 Bacillus sp. 1

1а B. polymyxa 2

D 1-1 Bacillus sp.

а – антагонист; б – патоген

Рисунок 1 – Антибиотическая активность бактериальных штаммов из рода Bacillus к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii через 20 суток культивирования, 2020 г. (ориг.) на питательных средах: 1 – КСА; 2 – Тайлона-3; 3 – ОА

На овсяном агаре в контроле возбудитель фомоза за 20 суток культивирования занял 83,0 % поверхности питательной среды.

Из 27 коллекционных бактерий рода Bacillus антагонистическую активность к Phoma macdonaldii через 20 суток совместного культивирования на ОА проявили 10 штаммов. Из них только один штамм 11-2 Bacillus sp показал зарастание поверхности питательной среды до 50 % без образования стерильной зоны (табл. 3).

Таблица 3

Антагонистическая активность штаммов бактерий из рода Bacillus к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii при температуре 25 °С на 20-е сутки культивирования на овсяном агаре г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %		Размер стерильной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Phoma macdonaldii	-	83,0	-
11-2 Bacillus sp.	33,0	1,2	0
D 1-1 Bacillus sp.	0,6	54,3	17,0
3-3 Bacillus sp.	2,4	58,0	17,0
K 1-1 B. subtilis	1,2	57,7	15,0
D 1-3 Bacillus sp.	2,5	57,8	14,0
D-10 Bacillus sp.	1,2	55,6	10,0
D 7-1 B. subtilis	2,3	52,5	10,0
Fa 4-2 Bacillus sp.	27,0	46,3	10,0
11-1 Bacillus sp.	1,2	43,2	1,8
Б (2-1) B. licheniformis	3,7	58,8	1,0

У остальных штаммов, проявивших антагонистическую активность к Phoma macdonaldii на ОА, отмечена стерильная зона 1,0–17,0 мм. Максимальная антибиотическая активность на этой среде установлена у штаммов D 1-1 Bacillus sp. и 3-3 Bacillus sp., у которых стерильная зона составила 17,0 мм (рис. 1.3).

Результаты оценки антагонистической активности штаммов бактерий из рода Pseudomonas к Phoma macdonaldii на трех питательных средах КСА, Кинга В и ОА показали, что механизм действия представлен одним типом – антагонист образует стерильную зону задержки роста мицелия патогена (антибиоз).

Из девяти коллекционных штаммов бактерий рода Pseudomonas антагонистическую активность к возбудителю фомоза через 20 суток совместного культивирования на двух средах КСА и Кинга В проявили восемь, а на ОА – семь штаммов (табл. 4).

Таблица 4

Антагонистическая активность штаммов бактерий-антагонистов рода Pseudomonas к возбудителю фомоза Phoma macdonaldii при температуре 25 °С на 20-е сутки культивирования на агаризированных питательных средах г. Краснодар, ВНИИМК, 2020 г.

Штамм-антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды, %			Размер стерильной зоны, мм
	антагонистом	патогеном
Картофельно-сахарозный агар
Phoma macdonaldii	-	100,0		-
Oif 2-1 Pseudomonas sp.	11,5	50,2		12,5
16-2 Pseudomonas sp.	7,1	61,1		12,0
12-2 Pseudomonas sp.	7,4	59,6		12,0
15-1 Pseudomonas sp.	8,5	50,6		9,5
13-2 Pseudomonas sp.	9,3	58,3		9,0
14-3 P. chlororaphis	4,9	56,8		9,0
Sgc-1 Pseudomonas sp.	14,0	61,1		5,5
14-4 Pseudomonas sp.	37,7	33,9		5,0
Кинга В
Phoma macdonaldii	-	68,4		-
16-2 Pseudomonas sp.	23,4	40,7		16,5
Sgc-1 Pseudomonas sp.	38,8	22,2		15,0
15-1 Pseudomonas sp.	17,8	36,0		15,0
14-4 Pseudomonas sp.	15,0	44,8		14,0
14-3 P. chlororaphis	16,3	41,6		13,0
12-2 Pseudomonas sp.	15,6	50,0		11,0
Oif 2-1 Pseudomonas sp.	15,7	40,5		10,0
13-2 Pseudomonas sp.	28,0	32,4		9,0
Овсяной агар
Phoma macdonaldii	-		83,0		-
Oif 2-1 Pseudomonas sp.	1,5		43,2		18,0
12-2 Pseudomonas sp.	1,0		57,7		17,0
16-2 Pseudomonas sp.	3,3		49,3		16,0
14-3 P. chlororaphis	1,9		55,5		16,0
Sgc-1 Pseudomonas sp.	3,0		59,2		15,0
14-4 Pseudomonas sp.	2,4		57,7		15,0
13-2 Pseudomonas sp.	2,2		61,1		11,0

На КСА в контроле за 20 суток культивирования Phoma macdonaldii занял 100 % поверхности питательной среды. Максимальную антибиотическую активность показали три штамма Oif 2-1 Pseudomonas sp., 16-2 Pseudomonas sp. и 12-2 Pseudomonas sp. , стерильная зона у которых составила 12,0–12,5 мм (рис. 2.1) .

На специализированной для бактерий рода Pseudomonas среде Кинга В в контроле возбудитель фомоза подсолнечника за 20 суток культивирования занял 68,4 % поверхности питательной среды. На этой среде у большинства коллекционных штаммов псевдомонад зона ингибирования патогена была выше, чем на КСА. Максимальную антибиотическую активность показал штамм 16-2 Pseudomonas sp., стерильная зона у которого составила 16,5 мм (рис. 2.2).

12-2 Pseudomonas sp. 1

16-2 Pseudomonas sp . 2

Oif 2-1 Pseudomonas sp .

а – антагонист; б – патоген

Рисунок 2 – Антибиотическая активность бактериальных штаммов из рода Pseudomonas к возбудителю фомоза подсолнечника Phoma macdonaldii через 20 суток культивирования, 2020 г. (ориг.), на питательных средах:

1 – КСА; 2 – Кинга В; 3 – ОА

На специализированной для фомоза среде ОА патоген за 20 суток культивирования занял 83,0 % поверхности пита- тельной среды. На этой среде большинство штаммов псевдомонад показали зону ингибирования патогена еще выше, чем на Кинга В. Максимальную антибиотическую активность к Phoma macdonaldii показал штамм Oif 2-1 Pseudomonas sp., у которого стерильная зона составила 18,0 мм (рис. 2.3).

Штаммы бактерий антагонистов, выделенные на первом этапе скрининга, будут оценены во вторичном скрининге, на фоне искусственного заражения возбудителем фомоза в лабораторных условиях во влажной камере и в грунте.

Выводы . В результате оценки 27 коллекционных штаммов бактерий рода Bacillus на трех питательных средах (КСА, Тайлона-3 и ОА) установлена антагонистическая активность у 24 штаммов. При этом у 21 штамма установлен один тип механизма действия против возбудителя фомоза подсолнечника – антибиоз. У трех штаммов ( Б (2-1) B. licheniformis, 11-2 Bacillus sp. – на КСА и 11-2 Bacillus sp. – на ОА) установлена конкуренция за площадь питания без образования стерильной зоны с патогеном. Максимальная стерильная зона к Phoma macdonaldii установлена у штаммов: 11-3 Bacillus sp. (21,0 мм) на КСА; Б-4 B. circulans (19,0 мм) на среде Тайлона-3; D 1-1 Bacillus sp. (17,0 мм) на ОА.

Из девяти коллекционных штаммов бактерий рода Pseudomonas антагонистическую активность к возбудителю фомоза на двух средах: КСА и Кинга В, проявили восемь, а на ОА – семь штаммов с одним типом механизма действия – антибиозом. Максимальную стерильную зону с Phoma macdonaldii сформировали штаммы: Oif 2-1 Pseudomonas sp. , 16-2 Pseudomonas sp . и 12-2 Pseudomonas sp. (12,0–12,5 мм) – на КСА; 16-2 Pseudomonas sp. (16,5 мм) – на Кинга В и Oif 2-1 Pseudomonas sp . (18,0 мм) – на ОА.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ и администрации Краснодарского края р_ Наставник № 19416-235003.