Первичный скрининг коллекционных грибных штаммов антагонистов к возбудителю фомоза рапса озимого

Автор: Маслиенко Л.В., Дейнега Л.А., Заверюха Е.А., Кузнецова А.В.

Журнал: Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур @vniimk

Рубрика: Агрохимия, агропочвоведение, защита и карантин растений

Статья в выпуске: 4 (200), 2024 года.

Бесплатный доступ

В лаборатории биометода агро-технологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК с целью разработки микробиологического метода снижения вредоносности наиболее опасной болезни рапса озимого - фомоза (Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, анаморфная стадия Phoma lingam (Tode) Desm.), в 2024 г. из рабочей коллекции проводили поиск перспективных штаммов-продуцентов микробиопрепаратов. В результате первичного скрининга выделено 26 перспективных грибных штаммов с разными типами антагонистической активности (конкуренция за площадь питания, гиперпаразитизм и антибиоз) против возбудителя фомоза: шесть штаммов из рода Trichoderma, семь - из рода Penicillium, четыре - из рода Chaetomium, три - из рода Aspergillus, два - из класса Basidiomycota, а также по одному из родов Sordaria, Metarhizium, Trichothecium и Talaromyces.

Еще

Фомоз, рапс озимый, первичный скрининг, грибные штаммы антагонисты, микробиологический метод

Короткий адрес: https://sciup.org/142243372

IDR: 142243372 | DOI: 10.25230/2412-608X-2024-4-200-107-113

Текст научной статьи Первичный скрининг коллекционных грибных штаммов антагонистов к возбудителю фомоза рапса озимого

Введение. Для снижения вредоносности одной из наиболее распространенных и опасных болезней рапса озимого – фо-моза (возбудитель Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not, анаморфная стадия Phoma lingam (Tode) Desm.) [1], актуальной задачей является разработка микробиологического метода. В условиях центральной зоны Краснодарского края, а в последние годы и в южных областях Нечерноземья, фомоз является одной из наиболее вредоносных болезней озимых культур семейства капустные, в том числе и рапса озимого, поражение которой может привести к снижению урожая до 40,0 %, а при раннем заражении – и к преждевременной гибели растений [2–5]. В качестве основных мер ее контроля рекомендуются: устойчивые сорта, уборка растительных остатков, соблюдение севооборота (срок возврата рапса на прежнее поле не ранее чем через 3–4 года), оптимальные сроки посева, пространственная изоляция, протравливание семян и применение фунгицидов во время вегетации культуры [6].

Зарегистрированных биопрепаратов от фомоза на рапсе в России нет. В лаборатории биометода агротехнологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, одной из немногих в России, многие годы ведутся исследования по разработке микробиологических средств защиты масличных культур от болезней. В основе разработанной в лаборатории концепции целенаправленного создания микробиопрепаратов для защиты масличных и других сельскохозяйственных культур от болезней лежит поиск штаммов антагонистов, безопасных для человека, нефитотоксичных, проявляющих высокую активность в широко варьируемых погодных условиях против комплекса патогенов, обладающих полифунк-циональным типом действия [7]. Начальным этапом этих исследований является ступенчатый скрининг вновь выделенных или коллекционных штаммов в лабораторных условиях in vitro.

Настоящая работа посвящена первому этапу ступенчатого скрининга – первичному скринингу коллекционных грибных штаммов к агрессивному изоляту возбудителя фомоза рапса озимого Phoma lingam in vitro.

Материалы и методы. Исследования проводили в лаборатории биометода агро-технологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в 2024 г. Объектом исследований служили: конидиальная стадия агрессивного изолята возбудителя фомоза рапса озимого Phoma lingam , выделенного в центральной зоне Краснодарского края; коллекционные штаммы грибных антагонистов возбудителей болезней масличных культур – 26 штаммов, представленных родами Trichoderma , Penicillium , Chaetomium , Sordaria , Metarhizium , Trichothecium, Talaromyces , Aspergillus , а также классом Basidiomycota.

Оценку антагонистической активности штаммов in vitro к агрессивному изоляту возбудителя фомоза рапса озимого проводили методом двойных или встречных культур [8]. Метод позволяет определить антагонистическую активность выделенных или коллекционных штаммов при совместном культивировании с возбудителем болезни (агрессивным изолятом) в одной чашке Петри.

Культуры грибных антагонистов и возбудителя болезни выращивали отдельно в течение пяти–семи суток на агаризирован-ной питательной среде. Стерильным сверлом размером 0,7 см вырезали блоки с мицелием антагониста и патогена и помещали в одну чашку Петри на расстоянии 6,0 см. Контролем служили культуры антагонистов и патогена, посеянные порознь. Антагонистов и патоген выращивали на картофельно-сахарозном агаре (КСА) [9] и на специализированной для грибов среде Рудакова [10]. Учёты взаимодействия патогена с антагонистами проводили на 20 сутки культивирования, отмечали:

- рост патогена и антагониста в % от площади чашки Петри (конкуренция за площадь питания);
- наличие или отсутствие зон задержки роста патогена в результате синтеза антагонистами гидролитических ферментов или веществ антибиотической природы (стерильная зона);
- нарастание антагониста на колонию патогена (гиперпаразитическая зона).

Результаты и обсуждения. Результаты первичной оценки коллекционных грибных штаммов к возбудителю фомоза рапса озимого Phoma lingam методом двойных или встречных культур на питательных средах КСА и Рудакова показали, что все штаммы проявили антагонистическую активность, при этом механизм антагонистического действия грибов представлен тремя типами: конкуренция за площадь питания, гиперпаразитизм и антибиоз.

Из 26 испытанных коллекционных штаммов грибов к возбудителю фомоза на среде КСА пять штаммов из рода Trichoderma (Т-1, Т-2, Т-3, Т-4 и Т-5 Trichoderma sp.) проявили тройной тип механизма антагонистической активности, заняв 100 % поверхности питательной среды, со стерильной зоной 4,5–5,5 мм и с гиперпаразитической зоной 0,5–3,7 см² (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза рапса озимого Phoma lingam при температуре 25 °С на 20-е сутки культивирования на среде КСА

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Штамм антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды				Размер стерильной зоны, мм	Размер гиперпаразитической зоны, см²
	антагонистом		патогеном
	%	см²	%	см²
Phoma lingam	-	-	27,6	17,5 ± 1,3	-	-
конкуренция за площадь питания + антибиоз + гиперпаразитизм
T-1 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	5,8	3,7 ± 0,1	4,5 ± 0,5	3,7 ± 0,1
T-2 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	1,3	0,8 ± 0,2	5,0 ± 0	0,8 ± 0,2
T-3 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	2,1	1,4 ± 0,2	5,5 ± 0,5	1,4 ± 0,2
T-4 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	0,8	0,5 ± 0,3	5,0 ± 0	0,5 ± 0,3
T-5 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	1,2	0,8 ± 0	5,5 ± 0,5	0,8 ± 0
конкуренция за площадь питания + антибиоз
Pv-3 Penicillium verrucosum	53,7	34,2 ± 1,8	18,5	11,8 ± 2,0	10,0 ± 0	0
Pk-1 Penicillium vermiculatum	56,1	35,7 ± 5,3	27,2	17,3 ± 2,0	8,0 ± 1,0	0
Pbc-1 Penicillium brevi-compactum	46,7	29,7 ± 0,7	35,2	22,4 ± 0,5	7,5 ± 0,5	0
Pp-1 Penicillium purpurescens	69,5	44,2 ± 3,9	12,4	7,9 ± 1,2	7,5 ± 2,5	0
Av-1 Aspergillus versicolor	64,8	41,3 ± 5,9	15,6	9,9 ± 1,1	7,5 ± 0,5	0
An-1 Aspergillus niger	66,3	41,2 ± 4,9	12,7	8,1 ± 4,0	7,5 ± 0,5	0
Af-1 Aspergillus flavus	53,9	34,3 ± 1,1	17,7	11,2 ± 1,9	6,5 ± 0,5	0
М-1 Metarhizium sp .	53,4	33,9 ± 1,5	15,2	9,7 ± 1,1	6,5 ± 0,5	0
Xk-1 Chaetomium olivaceum	61,6	39,3 ± 0,5	23,7	15,1 ± 1,5	6,0 ± 0	0
Pr-1 Penicillium rugulosum	25,8	16,5 ± 1,8	16,4	10,4 ± 0,6	5,5 ± 0,5	0
Xk-2 Chaetomium globosum	66,1	42,1 ± 3,2	18,7	11,8 ± 1,9	5,5 ± 0,5	0
Tt-1 Talaramyces trachispermus	25,8	16,4 ± 0,2	40,0	25,5 ± 0,3	5,5 ± 2,5	0
Хk-4 Chaetomium sp .	65,8	41,9 ± 1,3	21,3	13,5 ± 2,2	5,0 ± 0	0
Sm-1 Sordaria macrospora	80,3	51,1 ± 6,3	7,0	4,4 ± 2,4	5,0 ± 0	0
Pf-1 Penicillium funiculosum	58,7	37,4 ± 1,5	11,6	7,5 ± 0,2	4,5 ± 0,5	0
Tr-1 Trichothecium roseum	82,7	53,6 ± 0	10,4	6,6 ± 1,7	4,0 ± 1,0	0
A-1 Basidiomycota	86,9	55,3 ± 2,1	11,1	7,1 ± 1,8	3,5 ± 0,5	0
Хk-3 Chaetomium globosum	63,5	44,4 ± 0,2	16,4	10,4 ± 0,2	2,5 ± 0,5	0
M-24 Penicillium vermiculatum	53,7	34,2 ± 0,1	9,9	6,3 ± 4,7	1,5 ± 0,5	0
конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм
Tk-1 Trichoderma koningii	87,4	55,6 ± 0	25,2	16,0 ± 2,0	0	8,1 ± 3,5
И-3 Basidiomycota	53,5	34,0 ± 2,9	31,1	19,8 ± 2,7	0	3,1 ± 1,2

T-1 Trichoderma sp . T-3 Trichoderma sp . T-4 Trichoderma sp .

Рисунок 1 – Антагонистическая активность грибов рода Trichoderma к возбудителю фомоза рапса озимого Phoma lingam через 20 суток совместного культивирования на среде КСА при температуре 25 °С (ориг.) (ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.): а – колония патогена; б – колония антагониста; в – стерильная зона; г – гиперпаразитизм; д – конкуренция за площадь питания

Двойной тип механизма антагонистической активности (конкуренция за площадь питания и антибиоз) проявили семь штаммов из рода Penicillium (Pv-3 Penicillium verrucosum , Pk-1 Penicillium vermiculatum , Pbc-1 Penicillium brevi-compactum , Pp-1 Penicillium purpurescens , Pr-1 Penicillium rugulosum , Pf-1 Penicillium funiculosum и M-24 Penicillium vermiculatum ), четыре из рода Chaetomium (Xk-1 Chaetomium oliva-ceum , Xk-2 и Хk-3 Chaetomium globosum и Хk-4 Chaetomium sp . ), три из рода Aspergillus (Av-1 Aspergillus versicolor , An-1 Aspergillus niger и Af-1 Aspergillus flavus ), а также штаммы М-1 Metarhizium sp . , Tt-1

Talaramyces trachispermus , Sm-1 Sordaria macrospora , Tr-1 Trichothecium roseum и A-1 Basidiomycota . Вышеуказанные штаммы на 20 сутки заняли от 25,8 до 86,9 % площади поверхности питательной среды при таковой у патогена 7,0–40,0 %, а также образовали стерильную зону задержки роста патогена размером от 1,5 до 10,0 мм. Максимальная стерильная зона установлена у штаммов Pv-3 Penicillium verrucosum , Pk-1 Penicillium vermiculatum , Pbc-1 Penicillium brevi-compactum , Pp-1 Penicillium pur-purescens , Av-1 Aspergillus versicolor и An-1 Aspergillus niger – 7,5–10,0 мм (рис. 2).

Pv-3 Penicillium

Pk-1 Penicillium

Pbc-1 Penicillium

verrucosum vermiculatum brevi-compactum

Pp-1 Penicillium Av-1 Aspergillus An-1 Aspergillus purpurescens versicolor niger

Рисунок 2 – Антибиотическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза рапса озимого Phoma lingam через 20 суток совместного культивирования на среде КСА при температуре 25 °С (ориг.) (ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.): а – колония патогена; б – колония антагониста; в – стерильная зона

Штаммы И-3 Basidiomycota и Tk-1 Trichoderma koningii на среде КСА проявили двойной тип механизма антагонистической активности (конкуренция за площадь питания и гиперпаразитизм), заняв 53,5–87,4 % поверхности питательной среды при гиперпаразитической зоне 3,1– 8,1 см2 соответственно.

На специализированной для грибов питательной среде Рудакова у 12 штаммов (Т-1, Т-2, Т-3, Т-4 и Т-5 Trichoderma sp., Xk-1 Chaetomium olivaceum, Xk-2 и Хk-3 Chae-tomium globosum, и Хk-4 Chaetomium sp., И-3 и А-1 Basidiomycota и Tr-1 Trichothe-cium roseum) выявлен двойной тип антагонистической активности к возбудителю фо-моза рапса озимого Phoma lingam – конку- ренция за площадь питания и гиперпаразитизм (табл. 2). При этом максимальную конкуренцию за площадь питания проявили штаммы из рода Trichoderma (Т-1, Т-2, Т-3, Т-4 и Т-5), заняв 100 % поверхности питательной среды, а максимальная гиперпаразитическая зона выявлена у штаммов Xk-2 и Хk-3 Chaetomium glo-bosum, Tr-1 Trichothecium roseum и И-3 Ba-sidiomycota – 8,2–12,1 см2.

Таблица 2

Антагонистическая активность грибных штаммов к возбудителю фомоза рапса озимого Phoma lingam при температуре 25 °С на 20-е сутки культивирования на среде Рудакова

ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК, 2024 г.

Штамм антагонист	Площадь зарастания поверхности питательной среды				Размер стерильной зоны, мм	Размер гиперпаразитической зоны, см²
	антагонистом		патогеном
	%	см²	%	см²
Phoma lingam	-	-	78,0	49,1 ± 0,6	-	-
конкуренция за площадь питания + гиперпаразитизм
T-1 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	2,7	1,7 ± 0,2	0	1,7 ± 0,2
T-2 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	2,0	1,2 ± 0,5	0	1,2 ± 0,5
T-3 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	4,2	2,6 ± 0,2	0	2,6 ± 0,2
T-4 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	2,9	1,8 ± 0,1	0	1,8 ± 0,1
T-5 Trichoderma sp .	100	63,6 ± 0	6,0	2,1 ± 1,0	0	2,1 ± 1,0
Tr-1 Trichothecium roseum	100	63,6 ± 0	13,4	8,5 ± 1,7	0	8,5 ± 1,7
A-1 Basidiomycota	90,7	57,7 ± 2,9	14,3	9,1 ± 1,1	0	7,1 ± 0,9
Xk-2 Chaetomium globosum	81,4	51,7 ± 1,5	16,5	10,5 ± 2,1	0	8,2 ± 1,7
Xk-1 Chaetomium olivaceum	77,9	49,6 ± 2,2	17,7	11,3 ± 1,2	0	1,9 ± 0,3
Хk-4 Chaetomium sp .	75,3	47,9 ± 0	13,8	8,7 ± 0	0	6,8 ± 0
Хk-3 Chaetomium globosum	71,8	45,6 ± 1,0	16,8	10,6 ± 0,7	0	8,3 ± 0,5
И-3 Basidiomycota	58,9	37,4 ± 0,8	23,5	15,5 ± 0,5	0	12,1 ± 0,4
конкуренция за площадь питания + антибиоз
Av-1 Aspergillus versicolor	56,1	35,7 ± 0,4	33,1	21,0 ± 5,5	5,0 ± 1,0	0
Pr-1 Penicillium rugulosum	36,3	23,0 ± 1,6	46,6	29,6 ± 2,2	3,5 ± 0,5	0
Tk-1 Trichoderma koningii	100	63,6 ± 0	6,0	2,1 ± 0,7	2,5 ± 0,5	0
Pk-1 Penicillium vermiculatum	59,5	37,8 ± 5,4	33,2	21,1 ± 1,9	2,5 ± 0,5	0
Pbc-1 Penicillium brevi-compactum	54,9	34,9 ± 0,4	37,9	24,1 ± 0,6	2,5 ± 0,5	0
Pp-1 Penicillium purpurescens	52,8	33,5 ± 0,4	29,6	18,8 ± 0,7	2,5 ± 0,5	0
Af-1 Aspergillus flavus	58,3	37,1 ± 1,1	21,8	13,8 ± 0,7	2,5 ± 0,5	0
An-1 Aspergillus niger	87,4	55,5 ± 4,9	10,6	6,7 ± 3,6	2,0 ± 1,0	0
M-24 Penicillium vermiculatum	55,7	35,4 ± 0,1	35,0	22,2 ± 1,4	1,0 ± 0	0
Pv-3 Penicillium verrucosum	58,3	37,2 ± 1,7	39,5	25,1 ± 3,2	1,0 ± 0	0
конкуренция за площадь питания
Sm-1 Sordaria macrospora	97,8	62,2 ± 0,1	2,1	1,3 ± 0,1	0	0
Pf-1 Penicillium funiculosum	51,5	32,8 ± 1,0	47,8	30,4 ± 1,4	0	0
М-1 Metarhizium sp .	42,0	26,7 ± 0,3	43,9	27,9 ± 1,6	0	0

Конкуренцию за площадь питания и антибиоз проявили три штамма из рода Aspergillus (Av-1 Aspergillus versicolor , An-1 Aspergillus niger и Af-1 Aspergillus flavus ), шесть – из рода Penicillium (Pv-3 Penicillium verrucosum , Pk-1 Penicillium vermiculatum , Pbc-1 Penicillium brevi-compactum , Pp-1 Penicillium purpurescens , Pr-1 Penicillium rugulosum и M-24 Penicillium vermicula-tum ), а также штамм Tk-1 Trichoderma kon-ingii . При этом максимальную конкуренцию за площадь питания показал штамм Tk-1 Trichoderma koningii , заняв 100 % площади среды, а максимальный антибиоз – штаммы Pr-1 Penicillium rugulosum и Av-1 Aspergillus versicolor при стерильной зоне 3,5 и 5,0 мм соответственно. Только конкуренция за площадь питания выявлена у штаммов SM-1 Sordaria macrospora , Pf-1 Penicillium funiculosum и М-1 Metarhizium sp . , которые заняли от 42,0 до 97,8 % поверхности питательной среды, когда патоген при этом зарос всего на 2,1–47,8 %.

Таким образом, на двух питательных средах: КСА и Рудакова, выделено 26 перспективных грибных штаммов, проявивших антагонистическую активность к возбудителю фомоза рапса озимого с разными типами действия, для проведения вторичного скрининга на фоне искусственного заражения в лабораторных условиях во влажной камере.

Заключение. В результате первичного скрининга грибных штаммов антагонистов из рабочей коллекции лаборатории биометода агротехнологического отдела ФГБНУ ФНЦ ВНИИМК в 2024 г. на средах КСА и Рудакова выделены перспективные штаммы грибов с разными типами антагонистической активности к возбудителю фомоза рапса озимого: конкуренция за площадь питания, гиперпаразитизм и антибиоз. При этом пять штаммов из рода Trichoderma (Т-1, Т-2, Т-3, Т-4 и Т-5 Trichoderma sp.) проявили тройной тип механизма антагонистической активности. Максимальный антибиоз установлен у штаммов Pv-3 Penicillium verrucosum, Pk-1 Penicillium vermiculatum, Pbc-1 Penicillium brevi-compactum, Pp-1 Penicillium pur-purescens, Av-1 Aspergillus versicolor, An-1 Aspergillus niger и Pr-1 Penicillium rugu-losum, максимальная гиперпаразитическая зона – у штаммов Xk-2 и Хk-3 Chaetomium globosum, Tr-1 Trichothecium roseum и И-3 Basidiomycota, а максимальная конкуренция за площадь питания – у штамма Tk-1 Trichoderma koningii. Только конкуренция за площадь питания выявлена у штаммов Sm-1 Sordaria macrospora, Pf-1 Penicillium funiculosum и М-1 Metarhizium sp. В дальнейшем выделенные штаммы будут оценены во вторичном скрининге на фоне искусственного заражения возбудителем фо-моза рапса озимого в лабораторных условиях во влажной камере и в грунте.

Список литературы Первичный скрининг коллекционных грибных штаммов антагонистов к возбудителю фомоза рапса озимого

Index Fungorum Data Bases: [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://www.indexfungorum.org/names/Names_Record.asp?RecordID=230154 (дата обращения: 29.10.2024).
Бочкарев Н.И., Пивень В.Т., Тишков Н.М. [и др.]. Защита рапса // Защита и карантин растений. - 2017. - № S1. - С. 3776. EDN: XQQWJV
Сердюк О.А., Трубина В.С., Горлова Л.А. Влияние внутренней инфекции на всхожесть и масличность семян масличных культур семейства капустные // Масличные культуры. - 2019. - Вып. 3 (179). -С.119-123.
Gomzhina M.M., Gasich E.L. Plenodomus species infecting oilseed rape in Russia // Plant Protection News. - 2022. -No. 105 (3). - P. 135-147.
Костин Н.К., Кузнецова А.А., Дудченко И.П. [и др.]. Видовой состав микромицетов, ассоциированных с растениями рапса озимого некоторых регионов России // Сб. тезисов докладов конф. "Генетические технологии в микробиологии и микробное разнообразие", Пущино, 06-08 декабря 2022 г. - С. 56-59. EDN: HSIUQG
Гасич Е.Д. Фомоз рапса (обзор литературы) // Вестник защиты растений. -2004. - № 1. - С. 11-24. EDN: YKUWZV
Маслиенко Л.В. Лаборатория биологических средств защиты растений (вчера, сегодня, завтра) // История научных исследований во ВНИИМКе за 90 лет. - Краснодар, 2002. - С. 191-197.
Егоров Н.С. Выделение микробов антагонистов и биологические методы учета их антибиотической активности. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1957. - 78 с.
Лысак В.В., Желдакова Р.А., Фомина О.В. Микробиология. Практикум: пособие. - Минск: БГУ, 2015. - 115 с.
Рудаков О.Л. Микофильные грибы, их биология и практическое значение. -М.: Наука, 1981. - 160 с. EDN: UAJMLR

Еще

Статья научная