Первые результаты применения стволовых клеток в лечении стрессового недержания мочи у женщин

Недержание мочи при напряжении (НМпН) у женщин является не только очень большой социальной, медицинской и экономической нагрузкой на общество, но и серьезной проблемой для пациентки [1]. Развитие НМпН связано с различными факторами: слабостью мышц тазового дна; функциональной слабостью сфинктера уретры; дисплазией соединительной ткани, проявляющейся несостоятельностью фасций и связок переднего отдела влагалища; изменениями в сосудах и нервах, вызванных сдавлением; механической нагрузкой на подвешивающе-поддер-живающий аппарат таза при повышении внутрибрюшного давления, родах через естественные родовые пути [2, 3].

Существуют методы консервативного лечения НМпН, направленные на улучшение функции сфинктера уретры – тренировка мышц тазового дна (упражнения Кегеля), электростимуляция и фармакотерапия [1].

Радикальным методом лечения НМпН у женщин дающим хорошие отдаленные результаты, является хирургическое вмешательство, предполагающее замещение несостоятельной лонно-уретральной связки синтетической сетчатой лентой (общее название принципа операции – «петлевые (слинговые) операции»), которая создает опору для среднего отдела уретры и позволяет восстановить механизм удержания мочи [1].

Возможностьразвития интра- и послеоперационных осложнений и рецидивов НМпН являются основными не-достаткамихирургического лечения НМпНу женщин методом использования подуретрального слинга [4].

Не оправдало ожиданий клиницистов и использование инъекций объемобразующих веществ в область сфинктера уретры, хотя у некоторых пациенток был отмечен положительный эффект в виде восстановления удержания мочи [5].

Использование упомянутых методов лечения у ряда пациентокхоть и приводит к положительным результатам но они не устраняют основную причину заболевания: нарушение структуры и функции сфинктерного комплекса.

Недостатки традиционных методов лечения НМпН явились причиной поиска новых методов терапии этого заболевания. Таким методом стала попытка восстано- вить/улучшить функцию сфинктера уретры имплантацией стволовых клеток в область сфинктера с целью увеличения его мышечной массы и, соответственно, увеличения силы сокращения [6].

Доклинические исследования использования стволовых клеток для лечения НМпНдали многообещающие результаты [6-11]. Экспериментыпоказали, чтопримене-ние препаратов на основе стволовых клеток может повысить функцию сфинктера уретры у экспериментальных животных.

Несмотря на то,что в настоящее время клеточная терапия влечении НМпН все же находится на экспериментальной стадии, несколько центров сообщили о результатах клинического использования этого метода лечения НМпН у женщин [12-21]. Причем использовались различные типы клеток, включая стволовые клетки из мышечной ткани, пуповинной крови, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из жировой ткани [13-21]. Результаты данных исследований продемонстрировали разную эффективность клеточной терапии НМпН, однако все авторы отмечают наличие положительного эффекта и отсутствие интра- и послеоперационных осложнений.

В целом, с учетом полученных положительных результатов доклинических исследований с использованием жировых МСК и результатов клинических исследований I фазы начато клиническое исследование II фазы [9-11, 17, 20, 21].

Для оценки возможностей клеточной терапии при лечении НМпН важно определить оптимальный состав клеточного трансплантата, количество вводимых клеток разработать хирургическую технику введения, оценить отдаленные результаты и необходимость повторных трансплантаций. Это и явилось целью настоящего исследования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В 2018-2019 гг. в Клинике урологии Гродненского государственного медицинского университета проведено обследование и хирургическое лечение 74 женщин с недержанием мочи при напряжении II-III степени (по классификации International Continent Society).

Для лечения с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток было отобрано 10 пациенток.

Критериями включения в эту группу были:

• 1.    Отказ пациенток от выполнения подуретральной имплантации сетчатой ленты с позадилонным ее проведением;

• 2.    Избыточная масса тела пациентки (более 85 кг).

Критериями исключения были:

• 1.    Установленный диагноз рака даже после перенесенного радикального лечения;

• 2.    Цистоцеле 3-4 степени;

• 3.    Сахарный диабет.

Группу исследования составили пациентки в возрасте от 33 до 72 лет, средний возраст составил 56,2 года (σ = 11,08). Все пациентки обследованы однотипно. Выполнялись общеклинические лабораторные обследования, ультразвуковое исследование почек, мочевого пузыря, матки и ее придатков, обзорная и экскреторная урография с нисходящей цистограммой лежа и стоя на высоте пробы Вальсальвы, обследование на гинекологическом кресле с оценкой состояния стенок влагалища мобильности уретры, выполнением кашлевой пробы.

Все пациентки заполняли анкету для оценки качества жизни (рис. 1), связанного с удержанием мочи. Использовали адаптированную и измененную нами анкету Incontinence Quality of Life (I-QoL) [22]. Анализ результатов анкеты I-QoL проводили по следующей методике. У женщины, которая гипотетически не отмечает никаких расстройств удержания мочи и по всем 22 вопросам анкеты I-QoL оценивает качество своей жизни на 5 баллов общая сумма баллов составит 110. Эта величина принимается за 100% и рассматривается как «высокий уровень качества жизни». Сумма баллов в пределах 99-75% от максимально возможной расценивается как «незначи-

№	Вопрос Question	До операции Before surgery	После операции After surgery
1	Опасаюсь, что не успею дойти до туалета I'm afraid I won't be able to go to the toilet
2	Боюсь кашлять и чихать I'm afraid to cough and sneeze
3	Должна осторожно вставать со стула Must carefully get up from a chair
4	Волнует вопрос где находится туалет, когда нахожусь в новом месте Worried about the question of where the toilet is when I am in a new place
5	Имею депрессию I have depression
6	Чувствую себя привязанной. Не могу покинуть дом на продолжительное время I feel attached. Can't leave the house for a long time
7	Моя болезнь не позволяет мне делать то, что я хочу My illness does not allow me to do what I want
8	Думаю, что окружающие чувствуют запах мочи, исходящий от меня I think that people around me smell urine coming from me
9	Сознание того, что я не могу удержать мочу не дает мне покоя The knowledge that I can't hold urine does not give me rest
10	Должна часто посещать ванную Must go to the bathroom often
11	Недержание мочи заставляет меня детально обдумывать мои планы (продолжительный отъезд, посещение друзей, кинотеатра, пляжа) Urinary incontinence makes me think about my plans in detail (long trip, visiting friends, cinema, beach)
12	Меня беспокоит то, что моя болезнь усиливается с возрастом I'm concerned that my disease gets worse with age
13	Имею проблемы с непрерывным сном до утра I have problems with uninterrupted sleep until morning
14	Мне кажется, что моя болезнь раздражает окружающих It seems to me that my illness irritates others
15	Недержание мочи заставляет меня чувствовать себя больной Urinary incontinence makes me feel sick
16	Недержание мочи заставляет меня чувствовать себя бессильной Urinary incontinence makes me feel powerless
17	По причине болезни я меньше радуюсь жизни Due to illness, I enjoy life less
18	Боюсь, что буду мокрой I'm afraid I'll be wet
19	Чувствую, что не могу контролировать мой мочевой пузырь Feel, that I can't control my bladder
20	Должна контролировать что и сколько пить жидкости Must control what and how much to drink fluids
21	Болезнь ограничивает мой выбор одежды Illness limits my choice of clothes
22	Боюсь подтекания мочи при половом акте Fear of leakage of urine during intercourse

Примечание: в пустые клетки вносятся цифры, соответствующие оценке пациенткой своего состояния в баллах до и после операции:

1 - очень; 2 - достаточно сильно; 3 - средне; 4 - немного; 5 - нет.

Note: empty cells are filled with numbers corresponding to the patient's assessment of her condition in points before and after the operation: 1 - very; 2 - strong enough; 3 - medium; 4 - a little; 5 - no.

Рис. 1. Адаптированная анкета I-QoL для оценки качества жизни женщин с недержанием мочи

Fig. 1. Adapted I-QoL questionnaire to assess the quality of life of women with urinary incontinence

тельное снижение качества жизни»;74-50% – «умеренное снижение качества жизни»; 49-25% – «значительное снижение качества жизни»; 25% и меньше – «резко выраженное снижение качества жизни».

Такую же анкету пациентки заполняли через 12 месяцев после имплантации МСК.

Проведение всех этапов клеточной терапии начинали после получения добровольного информированного согласия пациенток на эксплантацию жировой ткани, процессинг и введение МСК, а также представ-лениерезультатов лечения в открытой печати приусло-вии сохранения анонимности. Первым этапом лечения являлась эксплантация жировой ткани. С целью минимизации воздействия местных анестетиков на ткань процедура проводилась под внутривенным наркозом. Разрезом по Пфанненштилю длиной 5-7 смрассекалась кожа. Подкожно-жировая клетчатка иссекалась скальпелем без использования электроножа для предотвращения повреждения жировой ткани. Проводился забор 15-20 г жировой ткани. Рана зашивалась послойно после осуществления гемостаза. На следующие сутки пациентка выписывалась из стационара.

Полученная жировая ткань в стерильном контейнере в 0,9% растворе хлорида натрия с антибиотиком (цефалоспорин III поколения) в течении 4-х часов доставлялась в ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси».

Выделение МСК проводили согласно методике описанной ранее [23]. Жировую ткань в стерильных условиях иссекали ножницами,гомогенизировали в слабо притертом гомогенизаторе и обрабатывали 0,1% раствором коллагеназы I типа (Sigma, США) в фосфатно-солевом буферном растворе (HyClone, США) рН 7,2 при 37ºС в течение 30 мин. Полученную клеточную суспензию фильтровали через фильтр (диаметр пор 100 мкм), центрифугировали при 370 g в течение 10 мин. После удаления супернатанта осадок заливали ростовой средой ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 2 мМ L-глютамина (Sigma, США), 1% базового раствора комплексного антибиотика-антимикотика (Sigma, США). Клетки высевали в количестве 2·10⁵ кл/см² в культуральные флаконы (Sarstedt, Германия) и культивировали в течение 24 ч при 37 ºС в СО 2 -инкубаторе во влажной воздушной атмосфере при 5% СО 2 . После этого среду с неадгезированными клетками удаляли и меняли на свежую. Последующую смену ростовой среды проводили каждые 72 ч. При достижении 70-80% конфлю-ентности монослоя клетки переводили в суспензию обрабатывая их раствором трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,02%) (Gibсo, США) и рассевали в количестве 5·10³ кл/см² на следующий пассаж. Для всех пациенток часть МСК третьего пассажа (2-3 млн клеток) крио-консервировали в жидком азоте под защитой ДМСО (10%) и сыворотки (50%).

Перед приготовлением инъекционного препарата содержащего МСК, проводился контроль иммунофенотипа клеток. С этой целью МСК в количестве 105 ресус-пендировали в 100 мкл фосфатно-солевого буферного раствора,вносили в суспензию связанные с флуорофорами антитела против антигенов CD34 (флуорофор РЕ-Cy7 – фикоэритрин-Cy7), CD44 и CD29 (флуорофор APC – аллофикоцианин), CD90 и CD105 (FITC – флуоресцеинизотиоцианат) и CD45 (APC-Cy7 – аллофикоцианин-Cy7) в разведениях согласно инструкции фирмы-производителя (Becton Dickinson, США). Клетки инкубировали втечение 30 мин втемнотепри комнатной температуре, промывали в фосфатно-солевом буферном растворе и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson, США). В качестве контроля использовали МСК, не инкубированные с антителами.

Для приготовления инъекционного препарата использовали МСК третьего пассажа. С целью обеспечения лучшей фиксации клеток в месте введения инъекционный препарат представлял собой биокомпозит в виде смеси МСК с носителем на основе желатина [11]. В качестве носителя применяли гемостатический препарат Спонгостан, изготовленный в форме порошка (Spоn-gostan Absorbable HaemostaticGelatin Powder), гидратированный в фосфатно-солевом буферном растворе. Для гидратации к 160 мг порошка добавляли 3 мл фосфатносолевого буферного раствора, перемешивали и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Далее к гидратированному порошку добавляли 1 мл суспензии МСК (8 млн клеток) в фосфатно-солевом буферном растворе, осторожно перемешивали и отбирали в стерильный шприц.

Вторым этапом хирургического лечения являлась имплантация МСК в стенку уретры и парауретральное пространство.

В условиях операционной под внутривенным наркозом после обработки операционного поля выполняли катетеризацию мочевого пузыря катетером Фолея 16 Ch. В средней третиуретры чресвлагалищно на3, 6 и 9 часах условного циферблата выполняли введение по 1 мл смеси МСК с носителем в стенку уретры и парауретральную область. Иглу располагали перпендикулярно оси уретры. Суммарно вводили 3 мл смеси, содержащей не менее 6 млн МСК. После выполнения инъекций устанавливали тампон во влагалище. Катетер Фолея извлекали через 24 часа после введения смеси стволовых клеток [24]. На вторые сутки после имплантации стволовых клеток все пациентки выписывались из стационара.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Все десять пациенток хорошо перенесли обе процедуры. Интраоперационных, ранних и поздних послеоперационных осложнений не было.

После извлечения катетера все пациентки мочились самостоятельно. При выполнении урофлоуметрии отмечено ослабление струи мочи и увеличение времени мочеиспускания, связанное с объем-образующим эффектом носителя. Остаточной мочи не было.

Результаты через 2 недели после имплантации

Выраженное снижение симптомов НМпН отмечали 7 пациенток, но при сильном кашле моча изуретры подтекала. Полное восстановление удержания при физической нагрузке отметили 2 пациентки, но их беспокоили симптомы гиперактивности мочевого пузыря – позывы на мочеиспускание, ургентное недержание мочи (недержание мочи при повелительном позыве на мочеиспускание). Не отмечала улучшения состояния по сравнению с дооперационным отмечала только 1 пациентка – недержание мочи при физической нагрузке сохранялось.

Результаты через 1 месяц после имплантации

В эти сроки наблюдения клиническая картина у всех пациенток не изменилась. Для купирования императивных расстройств мочеиспускания двум пациенткам назначены альфа-адреноблокаторы в сочетании с М-холино-блокаторами.

Результаты через 2 месяца после имплантации

Полностью удерживали мочу при физической нагрузке (кашлевая проба – отрицательная) 8 пациенток. Императивные расстройства мочеиспускания купированы медикаментозноу обеих пациенток. При сильном кашле и чихании 1 пациентка теряла малые объемы мочи (до 2 мл). Использование приемов поведенческой терапии (путем воздействия на режим мочеиспусканий – «тренировка мочевого пузыря» – пациентка мочилась через определенные временные интервалы)позволяли пациентке оценивать результат имплантации аутологичных МСК как удовлетворительный. Полностью сохранялось НМпН у 1 пациентки – потеря мочи при любой физической нагрузке.

Результаты через 6 месяцев после имплантации

Полностью удерживали мочу 9 женщин. Императивные расстройства мочеиспускания никто не отмечал что позволило отменить медикаментозную терапию альфа-блокаторами в сочетании с М-холино-блокато-рами у 2-х пациенток, у которых ранее такие расстройства мочеиспускания имели место. Только 1 пациентка теряла мочу при любой физической нагрузке.

Учитывая неэффективность клеточной терапии у этой пациентки решено выполнить имплантацию повторно с использованием криоконсервированных МСК. Пациентке еще раз проведена имплантация клеток по приведенной выше схеме.

Результаты через 12 месяцев после имплантации

Полностью удерживали мочу при физической нагрузке (кашель, чихание) 9 женщин. Императивных расстройств не отмечено. При осмотре на кресле дополнительных образований в проекции средней третиуретры не выявлено. При уретроцистоскопии дополнительныхобра- зований в просвете уретры и мочевого пузыря, а также признаков давления извне на уретру не выявлено. Паци- ентка,перенесшая повторную имплантациюаутологичных МСК, продолжала терять мочу при физической нагрузке. Ее состояние оставалось без улучшения (рис. 2).

Полное удержание

Full continence

Отсутствие изменений No change

Снижение потери мочи Reduced urine loss

Рис. 2. Динамика состояния удержания мочи сроки 2 недели, 1, 2, 6 и 12 месяцев после операции

Fig. 2. Dynamics of urinary continence at 2 weeks, 1, 2, 6 and 12 months after surgery

ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящеевремядлялечения НМпНуженщинраз-рабатываются и внедряются новые методы лечения - клеточная терапия препаратами на основе стволовых клеток что может повысить функцию сфинктера уретры. Применяются различныетипыклеток,включаястволовые клетки из мышечной ткани, пуповинной крови, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из жировой ткани и др. [13-21].

Нами проанализированы результаты использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток. При оценке анкет I-QoL у пациенток до операции количество балловварьировалоот 21до36 («резковыраженное снижение качества жизни» и «значительное снижение качества жизни»), а после операции – от 79 до 100 баллов («незначительное снижение качества жизни»), что подтверждает хороший результат имплантации аутологичных МСК. Большинство авторовтакже отмечают положительныере-зультатыи отсутствиеинтра- и послеоперационныхослож-нений[9, 11, 20, 21]припримененииклеточнойтерапиидля лечения стрессового недержания мочи у женщин.

I.M. Aragón, и соавт., отмечают, что данные, опубли-кованныевразличных клинических испытаниях с использованием стволовых клеток не мышечного происхождения, показали способность таких клеток восстанавливать поврежденный сфинктер [12]. Все эти типы клеток отвечают требованиям, предъявляемым к клеткам для тканевой инженерии, таким как использование аутологичных клеток, доступность с помощью минимально инвазивных процедур, обеспечение достаточного количества клеток способность к регенерации множества тканей и быстрое размножение хорошо контролируемым образом.

В исследовании K. Kuismanen, и соавт., наблюдалось пять пациенток с НМпН, которых лечили с исполь- зованием стволовых мезенхимальных клеток [17]. Препарат вводился через уретру с использованием цистоскопа и специальных игл. Только три женщины через 1 год после введения отмечали полное удержание мочи еще две – только улучшение состояния. Применяемый авторами метод требует наличия дополнительного специального оборудования.

ВЫВОДЫ

• 1.    Технически выполнение эксплантации и имплантации аутологичныхмезенхимальных стволовых клеток не представляет трудностей, малоинвазивно и не вызывает побочных эффектов.

• 2.    Положительный результат по критериям удержа-

• ния мочи, расстройств мочеиспускания и субъективной оценке качества жизни достигнут у 90% пациенток.

• 3.    Отсутствие даже небольшого положительного результата лечения недержания мочи при напряжении с использованием аутологичных мезенхимальных стволовых клеток у одной пациентки свидетельствует о том, что существуют патологические изменения органовмочеполовой системы, при которых клеточная терапия имеет низкую эффективность в устранении симптомов НМпН.

• 4.    Первые собственные результаты применения метода внушают осторожный оптимизм, но требуется продолжение исследований в связи с малым количеством наблюдений и необходимостью определения критериев с целью правильного подбора пациенток для клеточной терапии.