Пищевой пептид для предупреждения избыточной массы тела: виртуальный скрининг прогнозирования токсичности и выведения

Избыточная масса тела и ожирение становятся всемирной эпидемией и инициируют развитие неинфекционных заболеваний, включая сахарный диабет 2-го типа, сердечно-сосудистые заболевания, инсульт, рак, снижают продолжительность и качество жизни, могут приводить к депрессии [1]. Для ослабления развития ожирения предлагаются различные диеты и способы повышения уровня метаболизма. Но вместе с тем чрезмерные диетические вмешательства могут привести к нарушениям физического и психического здоровья [2], поэтому возрастает спрос на новые современные безопасные способы предупреждения ожирения без вреда для здоровья. Так для профилактики и лечения ожирения были предложены методы коррекции микробиоты кишечника. В частности, препарат Тempol снижает увеличение массы тела у лабораторных мышей за счет сокращения количества бактерий рода Lactobacillus в микробиоте кишечника [3]. Экстракт клюквы [4] увеличивает количество бактерий Akkermansia muciniphila в микробиоте кишечника и предупреждает ожирение, вызванное диетой. В исследованиях [5] установлено, что ежедневный прием A. muciniphila может противодействовать развитию ожирения, вызванного диетой с высоким содержанием жиров. Пероральное введение Bacteroides thetaiotaomicron [6] и Lactobacillus rhamnosus GG 13 ослабляет увеличение массы тела и развитие ожирения у мышей [7].

Поиск новых биологически активных веществ (БАВ), предупреждающих ожирение, является актуальным, так как эпидемия ожирения и связанные с ним метаболические осложнения продолжают оставаться серьезной проблемой здравоохранения из-за ограниченной эффективности методов лечения, особенно препаратов, которые можно принимать перорально.

К перспективным БАВ, способным снизить избыточную массу тела, относятся биопептиды. Биопептиды можно получать в результате ферментативного гидролиза белка [8]. Они биодоступны, безопасны и представляют собой отправную точку для разработки новых БАДов против ожирения [9]. В настоящее время получены ряд пептидов для предотвращения ожирения, в частности, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) [10], предсердный натрийуретический пептид и мозговой натрийуретический пептид [11]. У многих биопептидов последовательность аминокислот превышает 20, что приводит к их расщеплению протеолитическими ферментами в желудочно-кишечном тракте и, соответственно, потери направленности и биодоступности. Некоторые пептиды не могут проникать через слизистую оболочку кишечника, следовательно, требуется инъекция, что снижает удобство их применения. Следует отметить, что большинство населения для лечения ожирения предпочитают использовать БАДы и препараты для приема внутрь, чем препараты для инъекций. Следовательно, исследования биотехнологов должны быть посвящены разработке новых эффективных безопасных пептидов для профилактики и лечения перорального применения. Кроме того, пептиды не лишены недостатков – могут быть токсичны и вызывать побочные реакции [12]. Но вместе с тем в исследованиях [13] доказано, что пероральные пептидные препараты апелин и семаглутид высокоэффективны для снижения избыточной массы тела.

Авторами [14] разработан и оптимизирован пептид, состоящий из 9 аминокислот, обладающий высокой гидрофобностью и имеющий сходство с человеческим α-дефензином

5 (HD-5) [13]. На лабораторных мышах с индуцированным ожирением доказано, что полученный авторами [14] пептид обладает глюкорегуляторной способностью и предупреждает ожирение [15]. Но, прежде чем проектировать и создавать такие пептиды, желательно спрогнозировать их возможную токсичность и выведение из организма. В связи с этим целью исследований является прогнозирование токсичности и выведения биопептида, профилактирующего ожирение.

Материал и методы исследования

В качестве объекта исследований использован пептид со следующей последовательностью аминокислот CHAECGAACKEFCLEG, предупреждающий избыточную массу тела. Пептид имеет сходство с глюкагоноподобным пептидом-1 (GLP-1), регулирующим энергетический обмен. Характеристика пептида: общее гидрофобное соотношение - 53 %, общий заряд равен +0,25, гидрофобность пептида по Уимли - Уайту в целом остатке на уровне 4,63, молекулярная масса - 1556,826 Да, молекулярная формула - C 62 H 97 N 19 O 20 S 4 , потенциал связывания с белками (индекс Бомана) - 0,93 ккал/моль, изоэлектрическая точка - 6,77. Пептид хорошо растворим в воде.

Биологическая активности пептида по базе данных Peptide Ranker на уровне 0,858 при максимальной 1. Прогнозирование токсичности и выведения пептида проводили на платформе ADMETl ab 3 .

Результаты исследований и их обсуждение

Некоторые пептиды могут иметь врожденную токсичность in vivo . Поэтому важно создавать пептиды нетоксичными или менее токсичными для человека при сохранении их биоактивности. Авторами [15] создана модель прогнозирования токсичности антимикробных пептидов. Для выявления ключевых свойств, лежащих в основе токсичности антимикробных пептидов, был отобран комплексный набор признаков как физико-химического, так и лингвистического характера с локальными и глобальными значениями. После выбора признаков гибридная модель показала высокую эффективность.

Проведены исследования о прогнозировании токсичности пептида CHAECGAACK-EFCLEG (табл. 1).

Таблица 1

Результаты прогнозирования токсичности пептида GRCTKSICHFRWPGCPPICFPD

Показатель	Фактическое прогнозированное значение	Описание значений/результат
1	2	3
hERG-блокаторы, ед.	0	менее 0,3: не является hERG-блокаторами
Острая токсичность при приеме	0	менее 0,3: не является токсичным при приеме внутрь
внутрь, ед.		(более 500 мг/кг)
Пороговая токсическая доза,	0	менее 0–0,3: отрицательное значение токсичности
ммоль / кг массы тела в сутки		(> 0,011 ммоль / кг массы тела в сутки)
Канцерогенность	0,0	Менее 0–0,3: не канцерогенен
Гепатотоксичность для человека	0,035	0–1: не гепатотоксичен
Медикаментозная нефротоксичность, ед.	0,146	менее 0,3: не нефротоксичен при значении от 0 до 0,3
Раздражение слизистой оболочки	0,0	менее 0,3: не вызывающие раздражение
глаз, ед.		слизистой оболочки глаз

Продолжение таблицы 1

1	2	3
Раздражение слизистой оболочки дыхательных путей, ед.	0,0	менее 0,3: не вызывающие раздражение слизистой дыхательных путей
Иммунотоксичность RPMI-8226, ед.	0,006	менее 0,3: не иммунотоксичен в отношении клеточной линии RPMI-8226
Цитотоксичность в отношении клеток A549, ед.	0	менее 0,3: не токсичен в отношении клеток рака А 549
Цитотоксичность в отношении клеток Hek293, ед.	0	менее 0,3: не токсичен в отношении клеток рака Hek293
IGC50, log10[(мг/л)/(1000×МВТ)]	3,563	при значении 0–5 не токсичен
Взаимодействие с рецепторами: NR-AhR	не взаимодействует	не участвует в биосинтезе и не ингибирует нормальные функции стероидных гормонов, включая эстроген и андроген
NR-AR		не вызывает нарушения нормальной эндокринной функции, метаболического гомеостаза, репродукции, развития и поведенческих реакций
NR-ER-LBD		не взаимодействует с рецепторами стероидных гормонов ER и не вызывает нарушения нормальной эндокринной функции
NR-PPAR-гамма	взаимодействует с PPAR-гамма-рецепто-ром	участвует в регуляции метаболизма глюкозы и липидов
SR-ATAD5	не активирует ген ELG1 (SR-человеческий ATAD5)	не приводит к нарушению репликации ДНК белка ATAD5
SR-HSE	не активирует ген белка теплового шока SR-HSE	не вызывает активации реакции на тепловой шок
SR-MMP	не активирует ген белка, влияющий на мембранный потенциал митохондрий	не нарушает функции митохондрий
SR-p53	не активирует Рецепторы белка SR-p53	не повреждает ДНК

Во время деполяризации и реполяризации сердца калиевый канал, управляемый напряжением, кодируемый hERG, играл важную роль в регуляции обмена потенциалами действия сердца и потенциалами покоя. Блокада hERG приводила к нарушению в работе сердечной мышцы. Молекулы с IC50 > 10 мкм классифицируются как не блокаторы hERG (категория 0). Пептид не вызывал блокаду hERG и был отнесен к категории 0.

При прогнозировании отстрой токсичности на крысах было установлено, что пептид не обладал острой токсичностью, поэтому пороговую токсичную дозу установить не удалось.

Среди различных токсикологических конечных точек химических веществ канцерогенность вызывает большую озабоченность из-за ее серьезного воздействия на здоровье человека. Канцерогенный механизм химических веществ может быть обусловлен их способностью повреждать геном или нарушать процессы клеточного метаболизма. Многие БАВ и лекарственные препараты были идентифицированы как канцерогенные и изъяты с рынка. Установлено, что исследуемый пептид не обладал канцерогенностью.

Лекарственное повреждение печени вызывает серьезную озабоченность с точки зрения безопасности пациентов и является распространенной причиной отзыва лекарств с рынка. Побочные эффекты со стороны печени в ходе клинических испытаний часто приводят к позднему прекращению дорогостоящих программ разработки лекарств. Установлено, что пептид не гепа-тотоксичен.

Лекарственная (медикаментозная) нефротоксичность относится к вредным воздействиям на почки из-за действия химических веществ и медикаментов, известных как нефроток-сиканты. Из-за их ключевой роли в концентрировании и реабсорбции клубочкового фильтрата клетки проксимальных канальцев почек особенно подвержены повышенным уровням циркулирующих токсикантов. Значение медикаментозной нефротоксичности у пептида составило 0,146 ед., что свидетельствовало об ее отсутствии (менее 3).

Спрогнозирована токсичность пептида на клеточных линиях RPMI-8226 (множественная миелома) и A549 (клеточная линия рака легких человека). Установлено, что исследуемый пептид был не токсичен для вышеуказанных клеток. 48-часовой уровень IGC50 Tetrahymena pyriformis (концентрация исследуемого пептида в воде в мг/л, которая вызывает 50%-ное подавление роста Tetrahymena pyriformis через 48 ч) составил 3,563 -log10[(мг/л)/(1000×МВТ)], что свидетельствовало об отсутствии токсичности.

Проведена оценка токсичности по программе «Токсикология в XXI веке» (Tox21), которая включала идентификацию более 10 000 опасных и возможно опасных соединений, в частности взаимодействующих с рецептором андрогена (AR), арилуглеводородным рецептором (AhR) и другими [16]. В библиотеке соединений Tox21 используется панель из семи анализов рецепторов (NR) и пяти путей реакции на стресс (SR), что позволило получить наиболее значимые высококачественные данные о токсичности in vitro [17]. Данные, полученные с помощью Tox21, могут быть использованы для идентификации соединений, которые взаимодействуют с различными соединениями и образуют «токсические пути» [18]. Полученные данные можно сопоставлять с информацией о химической структуре вещества для обоснования того, вызовет ли химическое вещество определенный токсикологический результат in vitro [19, 20].

При прогнозировании токсичности по программе Tox21 идентифицируются химические вещества, взаимодействующие с рецепторами стероидных гормонов, например, с рецептором андрогена (AR) - рецептор ядерного гормона, который играет решающую роль в AR-зависимом раке предстательной железы и других заболеваниях, связанных с андрогенами. Химические вещества, разрушающие эндокринную систему (EDC) и их взаимодействие с рецепторами стероидных гормонов, такими как AR, могут вызывать нарушение нормальной эндокринной функции, а также нарушать метаболический гомеостаз, репродукцию, развитие и поведенческие функции. Установлено, что исследуемый пептид неактивен в отношении рецептора андрогена.

Арилуглеводородный рецептор (AhR) опосредует клеточные реакции на загрязнители окружающей среды, такие как ароматические углеводороды, посредством индукции ферментов фазы I и II и взаимодействует с другими сигнальными путями ядерных рецепторов. AhR относится к семейству основных факторов транскрипции «спираль - петля - спираль», имеет решающее значение для адаптивных реакций на изменения окружающей среды. Установлено, что исследуемый пептид неактивен в отношении рецептора андрогена и арилуглеводородного рецептора.

NR-ароматаза катализирует превращение андрогена в эстроген и играет ключевую роль в поддержании баланса андрогенов и эстрогенов в организме. Спрогнозировано, что пептид не участвует в биосинтезе и не ингибирует нормальные функции стероидных гормонов, включая эстроген и андроген, в организме.

Рецептор эстрогена (ER) играет важную роль в развитии, метаболическом гомеостазе и репродукции. Известны химические вещества, разрушающие эндокринную систему, и их взаимодействие с рецепторами стероидных гормонов, такими как ER, вызывает нарушение нормальной эндокринной функции. Поэтому важно понимать, имеется ли влияние пептида на сигнальный путь ER. Установлено, что пептид не активен в отношении рецептора эстрогена.

Рецепторы, активируемые пролифератором пероксисом (PPAR), представляют собой активируемые липидами факторы транскрипции суперсемейства ядерных рецепторов с тремя различными подтипами, а именно PPAR-альфа, PPAR-дельта (также называемые PPAR-бета) и PPAR-гамма (PPARg). Все эти подтипы гетеродимеризуются с ретиноидным Х-рецептором (RXR) регулируют транскрипцию различных генов. PPAR-гамма-рецептор (рецептор глита-зона) участвует в регуляции метаболизма глюкозы и липидов. Установлено, что исследуемый пептид участвует в регуляции углеводного и липидного обмена, что подтверждает его целевую направленность.

Уровень белка гена ELG1 (SR - человеческий ATAD5) повышается в ответ на различные типы повреждений ДНК. Спрогнозировано, что пероральное введение исследуемого пептида не приводит к нарушению репликации ДНК белка ATAD5.

SR-HSE - белок теплового шока. Различные химические вещества, условия окружающей среды и стресс могут приводить к активации реакции на тепловой шок / реакции развернутого белка (HSR/UPR). Введение пептида не вызывает активации реакции на тепловой шок.

Показатель SR-MMP отражает изменение параметров функции митохондрий. Мембранный потенциал митохондрий (ММП) генерируется митохондриальной цепью переноса электронов, которая создает электрохимический градиент в результате серии окислительно-восстановительных реакций. Этот градиент стимулирует синтез АТФ, важнейшей молекулы для различных клеточных процессов. Измерение ММП в клетках обычно используется для оценки влияния химических веществ на функцию митохондрий. Снижение ММП можно обнаружить с помощью липофильных катионных флуоресцентных красителей. Установлено, что пептид не оказывает отрицательного влияния на функцию и мембранный потенциал митохондрий.

SR-p53 – показатель повреждения ДНК. р53 - белок-супрессор опухолей, активируется после клеточного инсульта, включая повреждение ДНК и другие клеточные стрессы. Активация р53 регулирует жизнеспособность клеток, индуцируя репарацию ДНК, остановку клеточного цикла, апоптоз или клеточное старение. Следовательно, активация р53 является хорошим индикатором повреждения ДНК и других клеточных стрессов. Пептид не вызывает активации белка р53.

Таким образом, спрогнозировано, что пероральное введение пептида не оказывает токсического действия на клетки, органы, системы органов и организм в целом. В таблице 2 представлен виртуальный скрининг по выведению пептида из организма.

Таблица 2

Виртуальный скрининг по выведению пептида из организма

Показатель	Фактическое прогнозированное значение	Описание значений/результат
Плазменный клиренс (CL плазма), мл/мин/кг	1,35	низкий клиренс: <5 мл/мин/ кг; обеспечивается устойчивая концентрация в плазме крови
Период полувыведения (T1 /2), ч	4,46	средний период полувыведения

Плазменный клиренс (CL plasma ) характеризует скорость и количество выведения из организма химического вещества. По плазменному клиренсу определяют необходимую профилактическую и терапевтическую дозировку лекарственных веществ и БАВ, обеспечивающую стабильную концентрацию в плазме. Следует отметить, что большинство пептидов характеризуются высоким плазменным клиренсом, поэтому их часто используют для доставки лекарственных веществ в плазму или связывают с другими БАВ, способные постепенно высвобождаться в плазме. Исследуемый пептид характеризовался низким плазменным клиренсом (1,35 мл/мин/кг).

Средний период полувыведения БАВ и лекарств составляет от 4 до 8 ч. У исследуемого пептида период полувыведения составил 4,46 ч, в то время как у большинства пептидов T 1/2

короткий, что не позволяет их использовать как эффективный функциональный ингредиент для пищевой продукции и профилактических средств, предупреждающих ожирение.

Заключение

В результате проведенных исследований спрогнозирована токсичность пептида, предупреждающего ожирение. Показано, что исследуемый пептид не вызывает острую токсичность, гепатотоксичность, цитотоксичность, не оказывает отрицательного влияния на деятельность сердца, не активирует рецепторы генов белков теплового шока, не вызывает повреждения ДНК, нарушения функций митохондрий при приеме внутрь. Пептид характеризуется средним периодом полувыведения и низким плазменным клиренсом, что позволяет считать его эффективным. Следует отметить, что прогнозируемые характеристики не всегда совпадают с фактическими значениями, полученными в экспериментах in vitro . Поэтому возможно рекомендовать пептид для включения в состав продуктов питания специализированного и профилактического назначения при условии доказательства эффективности в доклинических и клинических исследованиях.