Подбор носителей и параметров иммобилизации консорциума микроорганизмов-деструкторов фосфатов

Введение . Ежегодно в окружающую среду сбрасывается огромное количество загрязняющих веществ, и чистых источников воды становится все меньше. В связи с этим одной из актуальных проблем стал поиск способов удаления биогенных элементов (азота и фосфора) из сточных вод. Биогенные элементы поступают в водоемы совместно с бытовыми, промышленными, сельскохозяйственными стоками и способствуют развитию процесса эвтрофикации [7]. Данный процесс характеризуется бурным ростом водорослей и высших растений, вследствие чего водоем постепенно зарастает, количество органических веществ увеличивается, а концентрация растворенного кислорода уменьшается, что приводит к гибели рыб и других живых организмов. Также повышенная концентрация фосфора в питьевой воде способна оказывать негативное воздействие на организм человека и животных [3].

Растворимый фосфор является основным лимитирующим элементом для процесса эвтрофикации. При концентрации фосфора менее 0,2 мг/л этот процесс не наблюдается. Для предотвращения эвтрофикации водоема экономически целесообразнее и проще удалять соединения фосфора, чем азота [4]. Фосфаты из сточных вод удаляются химическими, физикохимическими и биологическими методами. Применения химического способа стараются избегать из-за высокой стоимости реагентов и возможности вторичного загрязнения. Физикохимические методы не находят широкого практического применения в связи с высокими за- тратами, необходимыми на осуществление процессов, и сложностью эксплуатации. Биологический метод является наиболее экономически выгодным и безопасным, но не всегда высокоэффективным [5, 6].

Применение иммобилизованных микроорганизмов является одним из способов повышения эффективности биологической очистки сточных вод. При разработке биологического способа очистки существует две основные задачи: первая заключается в освобождении воды от загрязняющих веществ, вторая направлена на очищение воды от суспендированных микроорганизмов. Обе эти задачи решаются при использовании иммобилизованной микрофлоры [1, 2].

Цель работы. Подбор параметров иммобилизации консорциума микроорганизмов-деструкторов фосфатов на разные носители для увеличения показателей эффективности очистки сточных вод.

Объекты и методы исследования. Экспериментальные исследования проводились в лаборатории Научно-исследовательского института биотехнологии (НИИ биотехнологии) при ФГБОУ ВО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)».

В качестве объектов исследования использовали микроорганизмы-деструкторы фосфатов: Acinetobacter sp. B3905, Bacillus sp. B5061, Pseudomonas facilis Г0405ВТ. Штаммы культивировали на питательной среде, содержащей пептон, мясной экстракт и хлорид натрия, при температуре 30±5 ^оС и рН 7±0,5 в течение 18±2 ч.

В качестве носителей для иммобилизации использовали:

– активированный уголь марки БАУ-К производства ООО «ПЗС«Уралхимсорб», г. Пермь, Россия. Размер частиц составляет от 3,6 до 7 мм. Сорбент имеет сильноразвитую общую пористость, широкий диапазон пор и значительную величину удельной поглощающей поверхности;

– активированный уголь марки ДАК (ГОСТ 6217-74) производства ООО «АРМАТЕХ», г. Санкт-Петербург, Россия. Обладает хорошей сорбционной емкостью и высокой пористостью;

– углеродную ткань «Урал» TM-4 производ- ства ОАО «Светлогорск Химволокно», г. Светлогорск, Беларусь. Она изготовлена на основе вискозной технической нити с содержанием углерода 90–99 %. Ткань обладает высокой химической стойкостью к кислотам и щелочам;

– керамзит фракции 5–10 мм производства ООО «Керамзит», г. Кемерово, Россия. Экологически чистый пористый материал на основе глины.

Иммобилизацию проводили с помощью адсорбционного метода . Для этого готовили суспензию микроорганизмов консорциума концентрацией 10⁷–10⁸ КОЕ/мл. Носители инкубировали с 10 мл суспензии в течение 2 часов при комнатной температуре и постоянном перемешивании 100 об/мин. Адсорбция происходила за счет ионного и электростатического взаимодействия между носителем и поверхностью клетки. Данный вид иммобилизации является наиболее мягким для живых клеток.

Сорбционную емкость носителей определя- ли по уменьшению концентрации клеток в культуральной жидкости после её инкубации с носителями. Для этого измеряли оптическую плотность суспензии микроорганизмов на спектрофотометре UNICO 1201 (США) с использованием кюветы толщиной 1 см и длиной волны 540 нм. В качестве контроля в первую кювету вносили фосфатный буфер, во вторую – исходную суспензию микроорганизмов, а в третью добавляли 1 мл суспензии и 3 мл фосфатного буфера. В результате измерения определили: Dисх= 1,647; Dобр=0,858.

Чтобы рассчитать количество клеток (мг) в 1 мл суспензии, взвешивали 3 пустых пробирки типа эппендорф и фиксировали среднее значение (m0=0,9446 г). Во взвешенные пробирки до- бавляли по 2 мл суспензии и центрифугировали в течение 5 минут при 12000 оборотах, отбирали супернатант, высушивали образцы при 40 оС до постоянной массы и взвешивали (m2=0,9461 г.). Путем подсчета определили, что для оптической плотности Dобр=0,858 г масса клеток составляет 0,75 мг.

По завершении процесса адсорбции суспен- зию микроорганизмов и носители разделяли путем фильтрования через бумажные фильтры типа «красная лента» и определяли оптическую плотность фильтратов (D1ф), далее носители промывали фосфатным буфером, фильтровали и снова измеряли оптическую плотность фильтратов после промывки (D2ф). Для подсчета количества адсорбированных клеток X (мг/мл) использовали следующие формулы:

Х ₌ £ С ^Т5 .₁₀ ;           (1)

D cop = D ucx - (D 1 ф + D 2 ф ),      (2)

где D сор – оптическая плотность суспензии после инкубации микроорганизмов и носителя в течение 2 часов; D обр – оптическая плотность исходной суспензии; D исх – оптическая плотность суспензии 1,647 опт. ед.; D 1ф – оптическая плотность первого фильтрата, D 2ф – оптическая плотность фильтрата после промывки носителей.

Результаты и их обсуждение . Одним из главных показателей при отборе носителей для иммобилизации является их сорбционная емкость. Результаты её исследования представлены в таблице 1 в виде средних значений, полученных не менее чем в трех независимых испытаниях.

Таблица 1

Способность микроорганизмов адсорбироваться на поверхности носителей

Носитель	D 1ф	D 2ф	D исх	D сор	Концентрация клеток Х, мг/мл	Сорбционная емкость, мг/г
Активированный уголь марки БАУ-К	0,002	0,000	1,647	1,645	14,379	28,759
Активированный уголь марки ДАК	0,257	0,026	1,647	1,364	11,923	23,846
Углеродная ткань «Урал» TM-4	0,328	0,085	1,647	1,234	10,787	21,573
Керамзит	0,094	0,012	1,647	1,541	13,472	26,940

Все исследуемые носители обладают достаточно высокой способностью адсорбировать на своей поверхности клетки микроорганизмов. Однако наилучшие результаты показали активированный уголь марки БАУ-К и керамзит, данные носители использовали при дальнейшем исследовании.

Далее проводили подбор оптимальной температуры и продолжительности иммобилизации. Температуру варьировали от 10 до 50 оС, влияние продолжительности процесса оценивали через 1, 2, 4, 6 и 12 ч. Результаты учитывали с помощью фотоколориметрического метода путем измерения оптической плотности при длине волны 600 нм после суточного культивирования иммобилизованных микроорганизмов на выбранной ранее оптимальной питательной среде. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2

Носитель	Продолжительность иммобилизации, ч	Температура, оС	Концентрация микроорганизмов ∙108 КОЕ/мл	Изменение концентрации биомассы, %
1	2	3	4	5
Активированный уголь марки БАУ-К	1	10	0,28±0,01	-75,65
		20	0,76±0,04	-33,91
		30	1,21±0,06	+5,22
		40	0,87±0,04	-24,35
		50	0,30±0,02	-73,91
	2	10	0,31±0,02	-73,04
		20	0,98±0,05	-14,78
		30	2,17±0,11	+88,70
		40	1,82±0,09	+58,26
		50	0,39±0,02	-66,09
	4	10	0,24±0,01	-79,13
		20	0,91±0,05	-20,87
		30	2,01±0,10	+74,78
		40	1,62±0,08	+40,87
		50	0,38±0,02	-66,96
	6	10	0,22±0,01	-80,87
		20	0,88±0,04	-23,48
		30	1,98±0,10	+72,17
		40	1,41±0,07	+22,61
		50	0,31±0,02	-73,04
	12	10	0,21±0,01	-81,74
		20	0,78±0,04	-32,17
		30	1,05±0,05	-8,70
		40	0,87±0,04	-24,35
		50	0,18±0,01	-84,35
Керамзит	1	10	0,17±0,01	-85,22
		20	0,46±0,02	-60,00
		30	1,04±0,05	-9,56
		40	1,06±0,05	-7,83
		50	0,14±0,01	-87,83

Окончание табл. 2

1	2	3	4	5
	2	10	0,26±0,01	-77,39
		20	0,78±0,04	-32,17
		30	1,53±0,08	+33,04
		40	1,26±0,06	+9,56
		50	0,23±0,01	-80,0
	4	10	0,29±0,01	-74,78
		20	0,78±0,4	-32,17
		30	1,49±0,07	+29,56
		40	1,10±0,05	-4,34
		50	0,19±0,01	-83,48
	6	10	0,24±0,01	-79,13
		20	0,75±0,04	-34,78
		30	1,59±0,08	+38,26
		40	1,26±0,06	+9,57
		50	0,21±0,01	-81,74
	12	10	0,22±0,01	-80,87
		20	0,67±0,03	-41,74
		30	1,25±0,06	+8,70
		40	0,94±0,05	-18,26
		50	0,13±0,01	-88,69
Контроль	–	–	1,15±0,06	–

Подбор оптимальных условий иммобилизации консорциума микроорганизмов-деструкторов фосфатов

Проанализировав полученные результаты, в качестве оптимальных параметров иммобилизации выбрали температуру 30 оС и продолжительность процесса 2 часа, так как при данных значениях наблюдался максимальный прирост биомассы после культивирования.

Важным показателем иммобилизованных микроорганизмов является также возможность их многократного использования без потери прироста биомассы. Для определения воспроизводимости результатов проводили культивирование иммобилизованной системы при пятикратной смене питательной среды. Результаты учитывали с помощью фотоколориметрического метода, описанного выше (табл. 3).

Таблица 3

Результаты многократного культивирования иммобилизованных микроорганизмов

Носитель	Номер пересева	Концентрация микроорганизмов ∙108 КОЕ/мл
Активированный уголь БАУ-К	1	2,36±0,12
	2	2,32±0,12
	3	2,37±0,12
	4	2,34±0,12
	5	2,33±0,12
Керамзит	1	1,98±0,11
	2	1,94±0,11
	3	1,79±0,11
	4	1,66±0,10
	5	1,64±0,10

Полученные результаты подтверждают возможность многократного (5 циклов) использования иммобилизованного консорциума без значительной потери интенсивности роста культур. 6.

Выводы. Оптимальными носителями для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов фосфатов выбраны активированный уголь марки БАУ-К и керамзит. Сорбционная емкость носителей составила 28,759 и 26,940 мг/г соответ-  7.

ственно.

Проведен подбор временных и температурных параметров иммобилизации. В качестве оптимальных параметров выбрали температуру 30 оС и продолжительность процесса 2 ч.

Исследована возможность многократного использования иммобилизованного консорциума без потери прироста биомассы.                  1

Практическое применение консорциума мик-    .

роорганизмов-деструкторов фосфатов, иммобилизованных на твердых носителях (активированном угле марки БАУ-К и керамзите), может заключаться в создании биофильтров в виде колоночных реакторов, заполненных данным материалом, и использоваться для очистки 2 промышленных сточных вод от избыточной . концентрации фосфатов и общего фосфора.