Подбор питательной среды для получения бактериального концентрата микробного консорциума

Введение . В современных условиях возросла доля заквасочных культур, полученных путем генной трансформации. С одной стороны, применение микроорганизмов с трансгенными свойствами ускоряет формирование функциональных свойств микроорганизмов, но, с другой стороны, такие микроорганизмы могут оказывать нежелательные воздействия на организм человека: аллергические реакции, подавление роста естественной микрофлоры организма. На этом фоне естественные популяции микроорганизмов остаются актуальными источниками производственно-ценных штаммов. Ранее был разработан способ получения микробного консорциума для производства кумыса и курунги, основанный на автоселекции микрофлоры кефирной грибковой закваски [2, 3]. Идентификация состава лактобактерий микробного консорциума показала ее соответствие естественно сложившейся популяции микроорганизмов курунги и кумыса. Установлена ее высокая антибиотическая активность по отношению к патогенной и гнилостной микрофлоре [3].

Следующим этапом исследований является создание бактериального концентрата микробного консорциума. Одним из ключевых моментов в разработке технологии многокомпонентного по составу бактериального концентрата является подбор питательной среды, обеспечивающий сбалансированный рост микрофлоры. В полученной микробной популяции устойчиво доминирующими являются клетки мезофильных лактобактерий и лактозонеусваиваю-щих дрожжей при наличии неустойчивого количества термофильных лактобактерий и лактозных дрожжей [2, 3]. Следовательно, при подборе питательной среды для микробного консорциума первоочередной задачей является обеспечение роста лактозонеус-ваивающих дрожжей и мезофильных лактобактерий.

Дрожжи и некоторые представители лактобактерий могут проявлять активность по отношению к другим углеводам помимо лактозы. Известно, что технологии приготовления хлеба из ржаной муки основаны на применении заквасок с использованием чистых культур лактобактерий и дрожжей. В состав заварок ржаной муки входят такие лактобактерии и дрожжи, как Lactobacillus plantarum, L. brevis, L. delbrueckii, L. fermentum, Saccharomyces cerevisiaе. Известно, что ржаная мука обладает высокой биологической ценностью и характеризуется большим удельным весом в составе водорастворимого бел-ково-углеводного комплекса [6].

Цель исследования : изучение возможности применения ржаной муки в питательной среде для получения бактериального концентрата микробного консорциума.

Задачи исследования :

• 1.    Изучить влияние дозы (1, 2, 3%) ржаной муки на рост биомассы и сохранения в ней сбалансированного соотношения основных групп микроорганизмов микробного консорциума.

• 2.    Установить влияние ржаной муки в питательной среде на агрегацию и адгезию микроорганизмов микробного консорциума.

• 3.    Исследовать качественные характеристики бактериального концентрата микробного консорциума.

Объекты и методы исследования . Объект исследования – инокулированные питательные среды на творожной сыворотке с разными дозами ржаной муки. В качестве инокулята использовали микробный консорциум, полученный автоселекцией комбинированной закваски, состоящей из кефирной грибковой закваски и L. acidophilus , L. bulgaricus , L. helveticus в соотношении 1 : 0,5 : 0,5 : 1 соответственно [3]. Для исследования применяли обойную ржаную муку по ГОСТ Р52809.

Рост биомассы измеряли по оптической плотности на фотометре КF-77 λ=550н; количественный учет дрожжей проводили методом предельных разведений по числу колониеобразующих единиц при высевах на плотные лактозно- и глюкознокартофельные среды, лактобактерий на среде ГМК; адгезивные свойства изучали по развернутому методу В.И. Брилис [1].

Результаты исследования и их обсуждение . Питательную среду готовили на осветленной творожной сыворотке с добавлением буферных солей и питательных компонентов. В подготовленную среду вводили разные дозы ржаной муки: 1 % – образец 1; 2 % – образец 2; 3 % – образец 3; без добавления ржаной муки – контрольный образец.

Исследуемые образцы стерилизовали при 120 °С в течение 30 мин, охлаждали до 30 °С, вносили 5 % инокулята микробного консорциума. Культивирование образцов проводили при 30 °С. Результаты исследований представлены на рисунках 1, 2.

Время, ч

Образец 1        Образец 2   -ж- Образец 3        контроль

Рис. 1. Динамика оптической плотности инокулированных питательных сред

Из рисунка 1 видно, что в образце 1 и 2 через 24 ч культивирования наблюдается максимальное увеличение значения оптической плотности среды до 1,17 и 1,3 ед. соответственно. В образце 3 через

24 ч культивирования значение оптической плотности питательной среды составило 0,8 ед., что на 0,07 ед. меньше, чем в контрольном образце.

Опыты

□ Дрожжи, сбраживающие лактозу

ЕЗ Дрожжи, несбраживающие лактозу

Опыты

□ Мезофильные лактобактерии

□ Термофильные лактобактерии б

а

Рис. 2. Динамика микробиологических показателей инокулированных питательных сред: а – дрожжей; б – лактобактерий

Из данных рисунка 2 следует, что наибольшее увеличение количества бактерий наблюдалось в образце 2: количество дрожжей, несбраживающих лактозу, составило 5∙108 КОЕ/см3, термофильных и мезофильных лактобактерий – 5·1010 и 4·1011 КОЕ/см3

соответственно. Дальнейшее увеличение дозы ржаной муки до 3 % в питательной среде приводило к угнетению роста микроорганизмов. Вероятно, это связано с гидрофильными свойствами углеводно- белкового комплекса ржаной муки, приводящей к снижению активности воды питательной среды.

Коллоидные свойства белков и полисахаридов ржаной муки влияют на пространственное располо- жение клеток. Результаты исследования влияния состава питательной среды на морфологические особенности колоний микроорганизмов представлены на рисунке 3.

а

б

в

Рис. 3. Влияние дозы ржаной муки на когезию микробного консорциума: а – контроль; б – образец 1; в – образец 2; г – образец 3

г

Данные рисунков 3 (б–г) показывают, что внесение ржаной муки в питательную среду приводит к агрегации клеток дрожжей и лактобацилл, формированию микроколоний. Наибольшая агрегация клеток микроорганизмов наблюдается в образце 2 (рис. 3, в). Согласно современным данным, наличие пищевых волокон в питательной среде способствует фиксации клеток на их поверхности. Из литературных данных известно, что твердая поверхность положительно воздействует на клетки микроорганизмов, так как концентрирует экзоферменты и питательные вещества на поверхности вблизи адсорбированных клеток, обеспечивая большую доступность для них, чем для обособленных клеток [4, 5].

Прикрепление микроорганизмов к поверхности осуществляется в результате адгезивных процессов. Адгезия – это способность микроорганизмов адсорбироваться на твердой поверхности. Адгезивная активность позволяет клетке адаптироваться к неблагоприятным воздействиям внешней среды и увеличить свою популяцию. В связи с этим дальнейшие исследования были направлены на изучение адгезивных свойств биомассы, полученной культивированием на питательных средах с добавлением 2 % ржаной муки (образец 2). В качестве контроля использовали образец, полученный на питательной среде без добавления ржаной муки (табл. 1).

Адгезивные свойства микробного консорциума

Таблица 1

Показатель	Опыт
	Образец 2	Контроль
Средний показатель адгезии (СПА)	4,6	3,2
Коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе (КУЭ), %	85	79
Индекс адгезивности (ИАМ)	5,4 + 1,1	4,0 + 1,5
Адгезивные свойства	Высокоадгезивные	Среднеадгезивные

Из данных таблицы 1 видно, что индекс адгезивности микробного консорциума в исследуемом образце выше контрольного на 0,6. Результаты исследования свидетельствуют, что присутствие ржаной муки в питательной среде стимулирует адгезивные процессы в микробном консорциуме.

Адгезия микроорганизмов на твердых поверхностях является жизненно важным приспособлением адаптации к различным средам обитания, обуславливает их стабильность и защитные свойства. Известно, что способность микроорганизмов приживаться в условиях желудочно-кишечного тракта обу- словлено их адгезивными свойствами. Адгезия микроорганизмов к эпителиальным поверхностям с последующей колонизацией в ЖКТ характеризует эффективность пробиотических микроорганизмов. Полученные данные показывают целесообразность добавления в питательную среду 2 % ржаной муки при создании бактериального концентрата микробного консорциума.

На основании проведенных исследований нами разработан бактериальный концентрат. Качественная характеристика полученного бактериального концентрата представлена в таблице 2.

Таблица 2

Показатель	Значение
Консистенция и внешний вид	Однородная жидкость. Допускается отделение сыворотки
Цвет	От кремового до светло-коричневого по всему объему, с темными включениями
Вкус и запах	Кисломолочный с привкусом ржаной муки
Массовая доля сухих веществ, %	7,2±0,5
Активная кислотность (рН)	5–7
Температура сквашивания, °С	28 + 2
Активность (продолжительность сквашивания 10 л при внесении концентрата с 1 ед активности), ч	10–12
Титруемая кислотность, °Т	120
Температура при выпуске с предприятия, °С	плюс 6 + 2
Продолжительность хранения, месс.	3
Количество микроорганизмов, КОЕ/см3, не менее: лактобактерии термофильные	5·1010
мезофильные	4·1011
дрожжи несбраживающие лактозу	5·108
сбраживающие лактозу	2·107

Качественная характеристика бактериального концентрата

Из данных таблицы 2 можно сделать вывод, что полученный жидкий бактериальный концентрат обладает высокой биохимической активностью, это делает возможным его применение как для производства кумыса и курунги, так и в качестве биологически активной добавки к пище.

Выводы

• 1.    Доказана возможность применения ржаной муки в питательной среде для наращивания биомассы микробного консорциума. Установлено, что внесение 2 % ржаной муки в питательную среду способст-

  вует увеличению прироста биомассы микробного консорциума, активному росту мезофильных лактобактерий до 4·10¹¹ КОЕ/см³ и дрожжей, несбраживающих лактозу, – до 5·10⁸ КОЕ/см³.

• 2.    Присутствие 2 % ржаной муки в питательной среде приводит к агрегации микробного сообщества и повышению его адгезивных свойств.

• 3.    Подобранные условия культивирования микробного консорциума позволяют получить бактериальный концентрат с высокой концентрацией жизнеспособных клеток и биохимической активностью.