Подбор состава питательной среды и условий культивирования Saccharomyces cerevisiae — продуцента кормового белка

Введение. Кормление очень важно для сельскохозяйственных животных, так как позволяет поддерживать генетическую продуктивность организма. Оно обеспечивает здоровье и воспроизводительную способность животного организма, а также способствует устойчивости к различным заболеваниям. Повышение производительности за счет лучшего питания определяется некоторыми взаимосвязанными факторами, такими как доступность питательных веществ, тип системы кормления и уровень управления кормлением [2, 3, 9].

Особенно важную роль в полноценном кормлении играет кормовой белок. Биомасса дрожжей является одним из полноценных кормов в биологическом отношении за счет содержания в кормовом продукте незаменимых аминокислот, витаминов и микроэлементов, разнообразных ферментов и гормонов, улучшающих не только обмен веществ, но и усвоение белков [6, 7, 8, 10].

Микробные продуценты кормового белка (дрожжей) часто выращивают на богатых питательных средах. Поэтому замена дорогостоящих компонентов питательной среды для их ферментации на более дешевые и эффективные аналоги является наиболее важным в технологии получения кормовых продуктов, позволяющая снизить не только себестоимость целевого продукта, но при этом решить и многие экологические проблемы сельскохозяйственного производства [1, 4, 5].

В связи с этим, целью данной научноисследовательской работы являлось исследование по подбору состава питательной среды и параметров культивирования продуцента белка - дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365.

Материалы и методы исследований. Исследования проводились в научно-исследовательской лаборатории кафедры Биотехнологии и химии имени профессора Н.Е. Павловской, в ЦКП «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» ФГБОУ ВО Орловский ГАУ.

Для использования штамма микроорганизма в качестве промышленного продуцента белка важно, чтобы процессы необходимого метаболита в клетке проходили непрерывно, обеспечивая интенсификацию роста биомассы.

В данной работе накопление белка проводили при помощи микробного продуцента Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365.

В качестве компонента питательной среды выращивания микробного продуцента рассматривали целлюлозосодержащее сырье - солому злаковых культур (пшеницы и гречихи), предварительно предобра-ботанную ультразвуком в подобранных оригинальных условиях: амплитуда колебания звуковода – 20 мкм, число циклов дезинтергации – 15 и с последующей обработкой гидролизата ферментом ЦеллоЛюкс-F (ЦлА – 2500 ед./гр.) в соотношении 5:1 (v/v) и продолжительностью реакции 70 минут [5].

Получение кормового белка включает в себя подготовку в дрожжанке посевного материала дрожжей S. cerevisiae ВКПМ Y-365, подготовку среды и воздуха, установление рабочих параметров процесса ферментации и непосредственно ферментацию.

Лиофильно высушенную культуру продуцента восстанавливали дистиллированной водой, засевали в пробирки со скошенным агаром, при температуре 27±0,5°С. Через 48 часов инкубации готовили суспензию дрожжей, равную 0,5 по McF, и засевали в 100 мл жидкой среды из расчёта 1:10 (v/v), инкубировали 1618 часов при температуре 28±5°С.

Культуру на экспоненциальной фазе стандартизовали на 0,5 по McF и инокулировали в лабораторный ферментер Minifors вместимостью до 3 л, снабженный барботером для подачи воздуха.

Контрольное глубинное культивирование S. cerevisiae ВКПМ Y-365 проводили на питательной среде, рекомендованной паспортом штамма, г/л: глюкоза - 20, дрожжевой экстракт – 5, пептон - 10, солодовое сусло – 10.

В качестве опытного варианта использовали питательную среду, рекомендованную паспортом штамма, но солодовое сусло заменяли на ферментолизат соломы злаковых культур в объеме, необходимом для получения 10 г/л глюкозы.

Режим культивирования сахаромицета стандартный, согласно паспорту микроорганизма: - продолжительность ферментации 36 часов; - частота оборотов мешалки - 120 мин-1. - температура 28°С; - рН 7,4 const.

Эффективность процесса культивирования кормового белка (дрожжей) определяли по конечной концентрации биомассы, г/л и выходу биомассы с единицы полезной емкости ферментера, то есть по экономическому коэффициенту.

Концентрацию биомассы определяли по формуле: .

Экономический коэффициент рассчитывали по формуле: .

В дальнейшем дрожжевую суспензию подвергали термолизу, чтобы снизить брожение клеток. Термолиз проводили в непрерывно действующем аппарате, где дрожжевая суспензия нагревалась глухим паром до 75оС и выдерживалась при этой же температуре не менее 45 мин. За это время погибают дрожжевые клетки и вся сопутствующая микрофлора. В процессе термолиза дрожжей вследствие частичного гидролиза белков и перехода в раствор содержимого погибших клеток увеличивается кислотность и содержание редуцирующих веществ (РВ).

После культивирования механически отделяли целевой продукт от среды, высушивали до 13% влажности, взвешивали и проводили определение «сырого» протеина по Кьельдалю (по ГОСТ Р 53951-2010).

Концентрацию глюкозы определяли глюкозоок-сидазным методом с применением коммерческого набора реагентов «Глюкоза ДДС» (АО «ДИАКОН-ДС», Россия) . Реакционная смесь состояла из 1 части нагрузки и 100 частей рабочего реагента. В качестве нагрузки выступала дистиллированная вода – для холостой пробы, стандартный раствор глюкозы – для калибровки; исследуемые образцы. Пробы тщательно перемешивали и инкубировали 5 минут при температуре +37°С, измеряли оптическую плотность против холостой, λ 500 нм, длина оптического пути 1 см. Концентрацию глюкозы рассчитывали по формуле:

^ап ^и ^ rj__ , где: С оп – концентрация глюкозы, в ммоль/л; С ст – 5,5 ммоль/л глюкозы в стандартном растворе; D оп. – оптическая плотность опытной пробы; D ст. – оптическая плотность стандарта.

Количественное определение редуцирующих веществ (РВ) проводили фотометрическим экспресс-методом, основанным на измерении уменьшения поглощения медно-щелочного раствора при 670 нм после 3 мин нагревания в пересчете на глюкозу.

Оптимизацию условий культивирования микробного продуцента кормового белка проводили по методу Бокса-Уилсона с реализацией полного факторного эксперимента (ПФЭ2²) Гаусса-Зейдаля и крутого восхождения. Параметром оптимизации ( Y) выбрали концентрацию биомассы, г/л; факторы варьирования: x 1 – концентрация глюкозы в питательной среде, г/л; x 2 – посевная доза микробного продуцента S. cerevisae , ед. мут. McF; x 3 – продолжительность культивирования продуцента, ч. (см. таблицу 1).

Уровень	Фактор
	X 1	X 2	X 3
min x j	5	0,5	50
max x j	20	2	200
x j 0	12,5	1,25	125
Δ x j	7,5	0,75	75

Таблица 1. Распределение уровней факторов культивирования S. cerevisiae ВКПМ Y-365 и матрица планирования эксперимента

№	Фактор
	X 0	X 1	X 2	X 3	X 1 X 2	X 1 X 3	X 2 X 3	X 1 X 2 X 3
1	1	-1	-1	-1	1	1	1	1
2	1	1	-1	-1	-1	-1	1	-1
3	1	-1	1	-1	-1	1	-1	-1
4	1	1	1	-1	1	-1	-1	1
5	1	-1	-1	1	1	-1	-1	-1
6	1	1	-1	1	-1	1	-1	1
7	1	-1	1	1	-1	-1	1	1
8	1	1	1	1	1	1	1	-1

Исследования проводили в трёхкратной повторности и в трёх сериях экспериментов. Статистическая обработка данных выполнена с использованием программы Microsoft Office Excell 10. Данные в таблицах – среднее значение с указанием доверительного интервала.

Результаты исследований и их обсуждение. Выбор наиболее перспективных объектов для биотехнологии кормового белка, с биологической точки зрения, являются штаммы дрожжей, по систематическому положению относящиеся к совершенным грибам [2]. Этим утверждением был аргументирован выбор микробного продуцента кормового белка - Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365. Данный штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт», его область применения - производство кормового белка.

Создание штамма - идеального источника для синтеза микробиологического белка основывается на изменении регуляции метаболической активности клетки путем внесения в геном клетки индуцированных мутаций с последующим отбором лучших вариантов. При этом необходимо контролировать не только положительные технологические и биологические свойства, но и образование токсичных веществ [11].

Основными достоинствами дрожжей с точки зрения биотехнологии является их высокая активность деления на разнообразных источниках сырья, особую ценность представляют дешевые и доступные варианты; наличие ферментов гликозилирования белков; стабильность генетической системы; безвредность для человека и животных. В представленных вариантах питательной среды предпочтения были сделаны в сторону удешевления субстрата за счет замены традиционного углеводного составляющего -глюкозы на ферментолизат, полученный из лигноцеллюлозных отходов сельскохозяйственного производства.

Первоначально была рассмотрена возможность роста микробного продуцента белка - Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365 на твердой питательной среде, стандартной (рекомендованной для данного штамма) и модифицированной (сусло заменено сахарным раствором, то есть ферментолизатом соломы злаковых культур) на чашках Петри.

Нами показано, что скорость роста микробного продуцента на модифицированной питательной среде, содержащей вместо солодового сусла ферментолизат соломы злаковых культур, на 6-е сутки культивирования на 17-19% больше, чем на рекомендованной питательной среде (рисунок 1).

Проведенное исследование показывает, что замена компонента рекомендованной питательной среды на более дешевый аналог положительно сказывается на росте микробного продуцента. Это связано с тем, что солодовое сусло состоит практически из мальтозы — солодового сахара, тогда как в фер-ментолизате (сахарном растворе) соломы злаковых культуре присутствуют ряд других легкосбраживае-мых сахаров – глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза и др.

При периодическом глубинном культивировании Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365 в ферментере нами было исследовано влияние углеводного состава питательной среды на ростовые характеристики продуцента и накопление целевого продукта ферментации (см. таблицу 2).

Рис. 1 - Влияние компонента питательной среды на скорость роста микробного продуцента в питательной среде, содержащей: а – сусло, б – ферментолизат соломы пшеницы, в – ферментолизат соломы гречихи

Таблица 2. Зависимость ростовых характеристик продуцента от углеводного состава среды

Показатели роста продуцента	сусло	ферментолизат
		соломы пшеницы	соломы гречихи
концентрация глюкозы, конечная, г/л	1,5	1,2	0,8
потребление глюкозы, %	82,5	94	96
прирост дрожжевых клеток, McF	7	8	9,8
концентрация биомассы, г/л	1,11	1,57	2,24
экономический коэффициент, McF /г	0,32	0,37	0,46
выход дрожжей, % от концентрации глюкозы начальной	30	35	44
«сырой» протеин, % в а.с.с	33	44	47

Согласно полученным данным при периодическом культивировании в глубинных условиях на рекомендованной и модифицированной питательной среде продуцента кормового белка Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365, потребление глюкозы микроорганизмом в среде с ферментолизатом соломы гречихи составил 96%, что на 16,4% больше, чем в среде рекомендованной; прирост дрожжевых клеток 9,8 McF – на 40% больше; выход дрожжей, 44% от концентрации глюкозы начальной – на 46,6% больше; выход «сырого» протеина 47% в а.с.с – на 42,4% больше соответственно.

Извлечение максимальной прибыли в производстве микробного белка связано с обеспечением эффективности экспоненциальной фазы роста при условии равенства скорости нарастания биофассы и коэффициента утилизации питательной среды. Непрерыв- ность процесса позволит сократить дополнительные расходы на обслуживание и простой оборудования, а также снизить риски вторичного обсеменения и контаминацию побочными продуктами метаболизма.

Для получения максимального прироста дрожжевой биомассы продуцента оптимизировали условия его глубинного культивирования на модифицированной питательной среде с использованием сахарного раствора (ферментолизата) соломы гречихи. В результате ПФЭ2² была получена математическая модель эксперимента с уравнением Y = b 0 + b 1 X 1 + b 2 X 2 + b 12 X 1 X 2 , которое адекватно описывает исследуемый процесс и пригодно для оптимизации. План эксперимента по оптимизации условий глубинного культивирования микробного продуцента на модифицированной питательной среде и его результаты представлены в таблице 3, 4.

Таблица 3. План эксперимента по оптимизации условий глубинного культивирования микробного продуцента на модифицирован ной питател ьной среде

x 1 , г/л	x 2 , McF	x 3 , ч	ӯ j , г	Δ ӯ i ×10-3	S 2 i ×10-5	G расч	G табл
5	0,5	50	1,16	4,46	4,13	0,34	0,43
20	0,5	50	1,05	6,82	9,70
5	2	50	1,19	5,25	5,73
20	2	50	1,25	6,35	8,40
5	0,5	200	1,01	3,67	2,80
20	0,5	200	1,26	4,46	4,13
5	2	200	1,33	1,04	2,25
20	2	200	1,57	6,55	8,92

Таблица 4. Результаты реализации плана эксперимента по оптимизации условий глубинного культивирования микробного продуцента на модифицированной питательной среде

		Фактор			Отклик
		X 1	X 2	X 3	ӯ мысл	ӯ реал
Коэффициенты, b j		0,156	0,116	0	-	-
Расчетный интервал, λ i		1,167	0,087	0	-	-
Расчетный интервал округленный, λ 0 i		1,20	0,007	0	-	-
Шаг по градиенту, δ x j		7,71	0,06	0	-	-
Эксперимент	1 x j	20,21	1,31	125	1,74	1,94
	2 x j	27,92	1,37	125	2,93	3,27
	3 x j	35,64	1,43	125	4,12	4,58
	4 x j	43,35	1,49	125	5,22	5,81
	5 x j	51,06	1,55	125	6,43	5,79

Математическая модель процесса культивирования микробного продуцента на модифицированной питательной среде имеет следующий вид – y = 1,226 + 0,156 Х 1 + 0,116 Х 2 + 0,119 Х 1 Х 2.

Оптимальными условиями культивирования Saccharomyces cerevisiae – продуцента кормового белка являются концентрация глюкозы в питательной среде 43,35 г/л, посевная доза микробного продуцента – 1,5 МcF, продолжительность культивирования 125 часов. При этих условиях концентрация дрожжевой биомассы составила 5,81 г/л. Крутое восхождение можно признать эффективным, так как полученный результат на 10% превышает теоретически рассчитанный.

Считается, что штаммы Saccharomyces cerevisiae способны расти при низкой концентрации углеводно- го субстрата в питательной среде, что не технологично и снижает экономическую эффективность процесса их культивирования [12]. В нашем исследовании показано, что эффективная концентрация глюкозы в питательной среде культивирования составляет 43,35 г/л, является не низкой и при этом продуцент эффективно наращивает биомассу, что дает основание процесс называть экономически эффективным. Согласно полученных расчетов, для получения 100 г кормовой биомассы необходимо 16,4 г сухой измельченной соломы, в частности, гречихи.

Полученные кормовые продукты имеют следующие содержания «сырого» протеина (%) и необходимых животным витаминов (таблица 5).

Таблица 5. Белково-витаминный состав кормовых продуктов, полученных при культивировании микробного продуцента Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365 на рекомендованной и модифицированной питательной среде

Показатели	Содержание в кормовых продуктах, полученных на питательной среде, содержащее
	Сусло (контрольный вариант)	ферментолизат соломы пшеницы	ферментолизат соломы гречихи
«сырой» протеин, %	33	44	47
В 1 (мг/г)	21	32	34
В 2 (мг/г)	8	12	14
В 3 (мг/г)	89	121	124
В 5 (мг/г)	11	14	16
Д 3 (мкг/г)	540	770	840
РВ, г/л	2,4	2,7	3,1

Полученные данные убедительно доказывают, что данный штамм обладает высокой продуктивностью и технологичностью при использовании новой модифицированной питательной среды с ферменто-лизатом соломы, в частности, гречихи.

Согласно ГОСТ 20083-74 «Дрожжи кормовые. Технические условия», полученные продукты соответствуют ГОСТ и относятся ко 2-ой и 3-ей группе кормовых дрожжей. Максимальное содержание «сырого» протеина – 44-47% накоплено при использовании ферментолизата соломы злаковых культур как компонента питательной среды культивирования микробного продуцента.

В кормовой биомассе, полученной при культивировании дрожжей на модифицированной питательной среде, содержание витаминов группы В и витамина Д 3 в среднем на 45-75% выше, чем при выращивании на контрольной питательной среде.

При этом данный микробный продуцент белка обладает и благоприятным биологическим свойством - отсутствием способности к брожению. Содержание РВ в конечном продукте говорит о том, что в нем присутствуют редуцирующие сахара, которые не будут приводить к вздутию животов при скармливании животных.

Выводы. Рассмотрена возможность роста микробного продуцента белка - Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-365 на твердой питательной среде, стандартной (рекомендованной для данного штамма) и модифицированной (сусло заменено сахарным раствором, то есть ферментолизатом соломы злаковых культур) в объеме, необходимом для получения 10 г/л глюкозы. Скорость роста микробного продуцента на модифицированной питательной среде на 6-е сутки культивирования на 17-19% больше, чем на питательной среде с суслом.