Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей в геноме подсолнечника, ассоциированных с генами устойчивости к расам заразихи Orobanche cumana Wallr

Введение. Подсолнечник ( Helianthus annuus L.) является одной из важнейших масличных культур в мире. Посевы подсолнечника подвержены влиянию многих биотических лимитирующих факторов, среди которых одним из самых вредоносных является паразитический сорняк – заразиха ( Orobanche cumana Wallr.).

Заразиха кумская встречается во многих странах Европы и Азии, особенно в Центральной и Восточной Европе, Испании, Турции, Китае, Израиле, Иране и Казахстане [1; 2]. В среднем потери урожая подсолнечника, вызванные заразихой, могут превышать 50 % при выращивании восприимчивых гибридов [3; 4; 5]. В настоящее время обнаружено восемь рас, обозначенных буквами от А до Н [6; 7; 8]. Сегрегация O. cumana по вирулентности впервые была описана в СССР как разница между способностью заразихи поражать разные генотипы подсолнечника. Расы были описаны как A и комплекс рас B [9]. Генетическая резистентность устойчивого к этим расам материала в конечном итоге стала неэффективной, так как появилась новая раса С, сильно повлиявшая на производство подсолнечника [10]. В южных регионах Российской Федерации сообщается о расах F, G и H заразихи [11]. В Казахстане были выявлены 12

расы С и G [9]. Присутствие расы H наблюдалось на северо-востоке Украины, наряду с биотипом с вирулентностью выше, чем раса H [12]. Существует значительная разница в распределении вирулентности, так как наиболее вирулентные расы обычно встречаются в районах вблизи Черного моря [13]. Раса E является доминирующей в области, зараженной O. cumana в Сербии, а раса F была обнаружена локально [14; 15].

Использование устойчивых сортов и гибридов подсолнечника считается наиболее экологичным подходом к борьбе с паразитом. Селекция генотипов, устойчивых к заразихе включает использование доступных и эффективных источников резистентности, перенос генов устойчивости в существующий селекционный материал и практические процедуры оценки для обеспечения достаточного качества отбора. Данный процесс должен вестись непрерывно, так как появление устойчивости к новой расе приводит к ее преодолению и появлению более агрессивной расы. У подсолнечника в отношении O. cumana описаны как качественно, так и количественно наследуемые гены резистентности. Качественная устойчивость к заразихе контролируется главными генами и зависит от расы [7]. Учитывая, что гены устойчивости быстро преодолеваются, необходимо искать новые источники устойчивости и комбинировать имеющиеся гены [16].

Гены устойчивости к заразихе обозначаются как Or. А. Вранчану и соавторы [17] идентифицировали пять единичных доминантных генов (Or1 – Or5) для устойчивости к пяти расам (A – E) заразихи. Они определили набор из пяти линий-дифференциаторов, устойчивых к пяти последовательным расам. Появление расы F привело к идентификации устойчивых генотипов, контролируемых одним доминантным геном Or6 [18; 19], двумя рецессивными генами or6or7 [20; 21] и двумя частично доминантными генами Or6Or7 [22]. Таким образом, разница в способе наследования обусловлена различным происхождением генетического материала. Ранее в селекционных программах подсолнечника использовались доминантные гены устойчивости к заразихе, вплоть до обнаружения рецессивной устойчивости. Рецессивные гены могут повлиять на более длительную устойчивость к соответствующему паразиту, но приводят к необходимости включения генов устойчивости в обе родительские линии для развития резистентного гибрида [20]. Большинство моделей, которые пытаются объяснить устойчивость, предполагает, что доминантная устойчивость является активным процессом, когда растение синтезирует соединения, мешающие паразиту. И наоборот, рецессивная резистентность может быть результатом того, что в растительных клетках отсутствуют некоторые факторы, необходимые для жизненного цикла патогена [16].

Точное определение локализации гена устойчивости необходимо для выявления маркеров, которые могут быть использованы в маркер-ассоциированной селекции (MAС). Ген Or5, контролирующий устойчивость к расе Е заразихи, был картирован в теломерной области хромосомы 3 [23; 24; 25]. Кроме того, обнаружены пять QTL для устойчивости к расе E и шесть QTL для устойчивости к расе F в семи разных хромосомах [19]. Фенотипическая дисперсия устойчивости к расе E главным образом объяснялась основным QTL or3.1 на хромосоме 3, связанным с признаком устойчивости или восприимчивости. Ближайшим маркером к гену устойчивости к расе выше F, предварительно обозначенным как orab-vl-8, был ORS683 с генетическим расстоянием 1,5 сМ на хромосоме 3 [2]. Хотя этот ген был картирован на той же хромосоме, что и Or5, авторы доказали, что два гена устойчивости различны. В то время как ген Or5 находится в верхнем конце хромосомы 3 с ближайшим микросателлитным маркером ORS1036, находящимся на 7,5 сМ ниже по карте, orab-vl-8 картирован в нижней области хромосомы 3. Позже, I. Imerovski et al. [26] картировали два основных QTL на хромосоме 3. Обозначили QTL or3.1 и QTL or3.2. QTL or3.1 был расположен в геномной области, где картирован предыдущий ген устойчивости к заразихе Or5, в то время как QTL or3.2 был идентифицирован в нижней области той же хромосомы. Авторы провели четыре различных скрещивания с четырьмя различными источниками устойчивости к заразихе и смогли идентифицировать основной QTL. Обнаружено, что во всех скрещиваниях QTL устойчивости находились в 3-й хромосоме. Были картированы от 2 до 23 значимых QTL в геноме подсолнечника. Ген устойчивости к расе F O. cumana был картирован на хромосоме 7 [27].

Для развития селекционной программы по подсолнечнику необходим поиск генов устойчивости к новым расам и подбор ДНК-маркеров к ним для развития маркер-ассоциированной селекции. Данные маркеры ускорят и упростят отбор по интересующему признаку. В связи с этим цель работы – поиск молекулярных маркеров для генов, контролирующих устойчивость к расе G заразихи в материале подсолнечника отечественной селекции на основе применения методов ПЦР с известными SSR и SCAR праймерами.

Для достижения цели необходимо решить следующие задачи:

• -    поиск молекулярных маркеров, сцепленных с геном устойчивости Or 7 к расе G заразихи О. cumana в линиях подсолнечника селекции ВНИИМК;

• -    оценка коллекции линий подсолнечника ВНИИМК, устойчивых и восприимчивых к расе G заразихи по международной классификации, методом полимеразной цепной реакции амплификации ДНК по SSR- и SCAR-маркерам, сцепленным с разной частотой рекомбинации с Or 7 ;

• -    определение пар гибридизации для получения потомства F 1 и F 2 для дальнейшего гибридологического анализа.

Материалы и методы. Материалом исследования служили шесть линий-доноров, устойчивых к расе G заразихи:

RGP1, RGP2, RGB, RGL1, RGL2, RGA, которые были созданы на центральной экспериментальной базе ВНИИМК с использованием источников разного происхождения, резистентных к расе G и всем предыдущим [28], а также линии ВК 101, ВК 678, ВК 680, селекции ВНИИМК восприимчивые к расе G заразихи.

Выделение и очистка ДНК.

ДНК подсолнечника выделили из верхушечных листьев молодых побегов вегетирующих растений. Отборы проводились из пяти индивидуальных растений каждого образца. Выделение ДНК производилось по методу M. Saghai-Maroof et аl. [29]. Для получения качественных образцов на одном из этапов использовали активированный уголь [30]. Навеску 0,2 г растительной ткани гомогенизировали с использованием гомогенизатора Speed Mill plus (Analytic Jena, Германия). Концентрацию ДНК в полученном препарате определяли по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете после разгонки в 1%-ном агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Проведение реакции.

Для проведения полимеразной цепной реакции использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-HCl, рН 8,8;  16,6 мM сульфата аммония; 1,5–3,0 мM MgCl2; 0,01 %

Tween 20; по 0,2 мM дезоксирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (Сибэнзим, Россия). Для амплификации использовали термоциклер S1000тм (BioRad, США). Условия амплификации: начальная денатурация – 2 мин 96 °С, затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: денатурация при 94 °С – 30 сек, отжиг при 60 °С в течение 40 сек, элонгация – 1 мин при 70 °С, финальная элонгация – 2 мин.

Для ПЦР анализа использовали два типа праймеров:

• -    SCAR (sequence characterized amplified region) [24];

• -    SSR (simple sequence repeat) [25].

0.0 П ORS1036 8.3 8.6 10.6

В общей сложности испытанию подверглись 17 пар праймеров. Нуклеотидные последовательности праймеров, фланкирующих ДНК-локусы, синтезированы фирмой «Синтол» (Россия).

Визуализация продуктов ПЦР.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1хSB-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE.2, Хеликон, Россия) в течение 1– 1,5 ч при силе тока 50–58 mA и напряжении 80–100, а также в полиакриламидном геле (8 %, 1хТБЕ) с использованием камеры VE-20 для вертикального электрофореза (Хеликон, Россия) в течение 2,5–3 ч при силе тока 40–50 mA и напряжении 200–230. Реакционную смесь (10–12 мкл) наносили на гель вместе с красителем бромфеноловым синим. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Результаты электрофореза документировали при помощи гель-документи-рующей видеосистемы BIO-PRINT (Vilber Lourmat, Франция). Размер фрагментов ДНК определяли с использованием программного обеспечения Bio-Capture (Vilber Lourmat, Франция) относительно маркера длины фрагментов ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Сибэнзим, Россия).

Результаты и обсуждение. Проведенный ранее анализ наследования признака устойчивости к расе G заразихи показал, что у линий устойчивость контролируется одним геном с неполным доминированием [31]. Для локализации гена используется анализ сцепления с молекулярным маркером. Для этой цели зарубежными исследователями были составлены молекулярно-генетические карты групп сцепления генома подсолнечника [25; 32]. На их основании проводился подбор генетических маркеров к гену Or 7 [32] (рис. 1).

ORS1112 ORS202 ■ORS665

15.1---ORS820

18.1---ORS683

24.3

ORS657

28.1

ORS1080

33.9---ORS1222

Рисунок 2 – Положение SSR и SCAR локусов, предположительно сцепленных с геном Or 7 в LG3 H. annuus

40.7---ORS485

43.5—U—ORS924

Рисунок 1 – Молекулярно-генетическая карта LG3 подсолнечника.

Микросателлитные маркерные локусы, амплифицированные полимеразной цепной реакцией и локализованные рядом с геном or_a b _-v l _- 8

Картирование, основанное на анализе сцепления, показывает лишь относительные расстояния между исследуемыми локусами, однако на данный момент проведена сборка репрезентативного генома H. annuus – HanXRQr1.0, включающего в себя физическую карту группы сцепления на основании данных полногеномного секвенирования методом дробовика [33; 34]. С помощью инструмента Basic Local Alignment Search Tool (BLAST^®) можно осуществлять поиск и сопоставление нуклеотидных последовательностей со сборкой репрезентативного генома, оценивать генетические расстояния изучаемых локусов в п.н., а в дальнейшем осуществлять поиск генов-кандидатов в искомой области [35] .

В рамках исследования используемые в работе SSR и SCAR локусы были сопоставлены со сборкой HanXRQr1.0. По этим данным составлена физическая карта положения локусов (рис. 2).

Локусы гибридизации для праймеров ORS 1036, RTS 05, ORS 1021 и ORS 777 не обнаружены в LG3, что может говорить об их положении в других группах или об отсутствии части последовательности в сборке репрезентативного генома HanXRQr1.0. Положения локусов на физической карте распределились на две условные группы, которые совпадали с составленной ранее молекулярно-генетической картой [32]. В верхней части LG3 располагается группа локусов, находящихся выше предполагаемого нахождения гена orab-vl-8 на молекулярно-генетической карте, а в нижней части

–

группа, помещенная ниже

данного гена. Также локусы верхней группы располагаются плотнее по отношению друг к другу, в отличие от локусов нижней группы, что тоже отмечено на молекулярно-генетической карте (рис. 1).

Таким образом, физическая карта локусов гибридизации может быть эффективным инструментом для более точного анализа и подбора маркеров. При появлении новых версий сборки генома карта будет актуализироваться.

Изучаемые линии подсолнечника были проанализированы на наличие полиморфизма по длине и наличие амплифи-цированных фрагментов ДНК при ПЦР с 15

используемыми праймерами (таблица).

Таблица

Амплифицированные фрагменты ДНК, полученные при проведении ПЦР с SSR-и SCAR-праймерами на ДНК родительских линий подсолнечника

Маркер	Генотип
	RGL1	RGL2	RGB	RGА	RGP1	RGP2	ВК678	ВК680	ВК101
ORS 665	294	294	294	294	294	294	294	294	294
ORS 485	324	324	324	324	324	324	324	324	324
ORS 683	400	400	400	400	400	400	364	364	364
ORS 1080	369	369	369	379	379	379	379	375	379
ORS 657	274	274	274	263	263	274	263	263	263
ORS 1222	490	490	490	490	490	490	490	490	490
ORS 1112	347 /375	347 /375	375	347 /375	375	347 /375	347	-	347
ORS 202	309	309	309	333	333	333	309	309	309
ORS 1040	200	200	-	200	200	200	192	200	200
ORS 777	315	315	315	315	315	315	315	315	315
ORS 1021	270	270	270	270	270	270	270	270	270
RTS 05	-	-	-	+*	+	+	+	-	+
RTS 40	-	+	-	-	-	-	-	+	+
RTS 40 (2)	-	+	-	-	-	-	-	+	+
RTS 28 (L)	-	-	-	-	-	-	-	-	-
ORS 432	163	163	163	163	163	163	163	163	163
RTS 29 (L)	1	1	1	2	2	2	2	2	2

* +/– присутствие/отсутствие амплифициро-ванного фрагмента

При оценке шести устойчивых и трех восприимчивых родительских линий полиморфизм по длине локуса показали маркеры: ORS 683, ORS 1112, ORS 1080, ORS 657, ORS 202, ORS 1040, RTS 29 (L). По принципу наличия/отсутствия ампли-фицированного фрагмента полиморфизм наблюдался по локусам RTS 05 и RTS 40. Оставшиеся маркеры показали себя мономорфными для всех изучаемых линий, и дальнейшее их применение в исследовании нецелесообразно. Для гибридологического анализа необходим подбор наибольшего количества полиморфных маркеров и контрастных линий по искомому признаку для гибридизации и оценки в F 1 и F 2 . Для этих целей выделили маркеры ORS 683 и ORS 1112, у которых была замечена связь полиморфизма маркера с восприимчивостью растений родительских линий к заразихе. Восприимчивые линии характеризовались аллелем ORS 683 длиной 364 п.н. (таблица) и полным отсутствием аллеля длиной 375 п.н. у локуса ORS 1112 (рис. 3). Данные 16

маркеры находятся в относительной близости к гену or_ab-vl-8 на молекулярногенетической карте ORS 683 – 1,5 сМ, ORS 1112 – 11,3 сМ (рис. 1), а на физической карте ORS 683 является самым близкорасположенным локусом к ORS 1112 с расстоянием между ними порядка 4,25 млн п.н. (рис. 2).

Рисунок 3 – Электрофоретические спектры локуса ORS 1112

Дорожки: 1, 4, 5 – RGL1; 2,3 – RGL2;

6–8 – RGВ; 9, 10 – RGА;

11, 12, 16 – RGP1; 13–15 – RGP2; 17 – ВК 678; 18 – ВК 680; 19 – ВК 101; М – маркер молекулярной массы 100 bp. Стрелкой обозначен фрагмент ДНК 375 п.н.

На основании вышеописанного, принято решение использовать маркеры ORS 683 и ORS 1112 как основные. Для гибридологического анализа выбраны пары для скрещиваний: RGP2 × ВК 680, ВК 678 × RGP2, ВК 680 × RGB, RGL1 × ВК 678, ВК 678 × RGP1, ВК 680 × RGL1 (RGL1 × ВК 680). Для гибридологического анализа будут использованы основные маркеры (для всех гибридных комбинаций), а также маркеры, показавшие полиморфизм между двумя родительскими формами.

Выводы. В результате проведенного исследования были определены маркеры для дальнейшей работы и выбраны пары для гибридизации и оценки в F 1 и F 2 . С помощью BLAST будет актуализироваться карта локусов и будут подобраны и созданы новые маркеры, расположенные в области поиска.