Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

Актуальность. Инфекционные заболевания, по-прежнему, остаются угрозой, являясь основной причиной смертности в развивающихся странах и серьезной проблемой для передовых стран [2,4]. Ухудшение экологической обстановки, эпидемия ВИЧ, широкое использование трансплантационной и противораковой терапии, рост числа хирургических вмешательств, широкое и необоснованное использование антибиотиков приводит к появлению заболеваний, с трудом поддающихся лечению существующими лекарственными препаратами [1,5]. Наблюдается стремительный рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне тяжело и характеризующимися высокой смертностью [3,6].

Противогрибковых препаратов относительно немного и они, как правило, высокотоксичны. Необходимы новые более совершенные противогрибковые антибиотики [1,4]. Актуальной и нерешенной до сих пор проблемой здравоохранения являются сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза [2,6], борьба с которыми в последнее время стала более эффективной благодаря применению ингибиторов биосинтеза холестерина [2,5]. Создаваемые на основе микробных биологически активных продуктов, эти препараты нередко обладают также способностью к противоопухолевому и противогрибковому действию [6].

Несмотря на ведущийся в развитых странах широкий скрининг антибиотиков, число новых препаратов, прошедших всесторонние испытания и рекомендованных к клиническому использованию, с каждым десятилетием снижается 4]. Существующие подходы трудоемки и не позволяют обеспечить должной эффективности поисковых исследований [5]. Методология поисковых работ нуждается в серьезном усовершенствовании.

Новая методология поиска, подразумевающая разработку современных тестов и создание рациональной схемы их использования, а также изучение биологически активных соединений, получаемых путем направленной химической трансформации генно-инженерных производных антибиотиков, могут существенно повысить эффективность поисковых работ и обеспечить создание новых лекарственных препаратов.

Цель исследования. Состояла в разработке новой методологии поиска биологически активных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС) и новых противогрибковых антибиотиков, в проведении поиска, изучении физико-химических и биологических свойств полученных препаратов.

Материалы и методы исследования. Работу проводили с микробными продуцентами антибиотиков - культурами актиномицетов и несовершенных грибов, свежевыделенных из природных источников (почва, морская вода), и культурами высших грибов, полученных из коллекции культур лаборатории биосинтеза биологически активных соединений АГМИ.

Результаты исследования. Предложена новая современная методология поиска микробных метаболитов -ИБС, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, основанная на использовании оригинальных тест-моделей - микроорганизмов Acremonium fusidioides, Halobacterium salinarum и культур клеток -человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4 и гепатобластомы G2 с обязательным предварительным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.

Разработаны и применены в поисковых исследованиях оригинальные методы работы с культурами продуцентов антибиотиков. Предложен новый подход к "активизации" микробных продуцентов на начальных этапах поиска путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов. Усовершенствованы методы выявления биологически активных микробных метаболитов в культуральной жидкости с применением микро- и ультрафильтрации, скоростного центрифугирования и лиофилизации.

На основе созданной схемы изыскания ИБС проведен широкий поиск антибиотиков, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, среди различных штаммов грибов и актиномицетов. Установлено, что способностью к образованию ИБС обладают не только несовершенные грибы, но и актиномицеты. Выделены ИБС, принадлежащие к различным классам химических соединений. Изучен механизм действия препаратов, подавляющих как ранние (включая действие ГМГ-КоА редуктазы), так и поздние этапы биосинтеза стеролов.

Получены новые сведения о характере гиполипидемического действия антибиотиков аскофуранона и энниатина В. Показано комплексное воздействие аскофуранона на синтез и метаболизм липидов в культуре клеток гепатобластомы G2. Аскофуранон подавляет одновременно синтез холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов и фосфолипидов, снижает содержание свободных жирных кислот.

Гиполипидемический эффект энниатина В в большей степени связан с подавлением

В настоящем исследовании проведен поиск биологически активных соединений среди микробных метаболитов, а также полусинтетических антибиотиков (полиены, олигомицины) и соединений, получаемых путем полного химического синтеза (аналоги антибиотика турбомицина).

Для повышения эффективности поисковых исследований предложены новые подходы, направленные на усовершенствование методов работы с микробными продуцентами и образуемыми ими микробными метаболитами, разработаны новые модели поиска ИБС, основанные на использовании микробных культур и линий клеток млекопитающих. Одна из предложенных моделей (Я. salinarum) позволяет проводить также поиск противоопухолевых соединений, как среди микробных метаболитов, так и среди препаратов, получаемых химическим синтезом, что показано на примере трисиндолилметанов. Все оригинальные микробные модели разработаны в варианте микрометодов, что позволяет резко интенсифицировать проведение отбора новых препаратов.

В результате широкого поиска ИБС среди природных метаболитов показано, что отобранные ИБС отличаются большим разнообразием по химической структуре и механизму действия. Выявлены препараты, обладающие выраженным гиполипидемическим действием.

Среди микроорганизмов, способных синтезировать ИБС, до 35-43% штаммов образуют ингибиторы ранних этапов мевалонатного синтеза, Актиномицеты, обладающие такой способностью, прежде были не известны.

Отдельные препараты проявили значительную противогрибковую активность. Наиболее высокой она оказалась у препарата 4883, отнесенного к группе антибиотика ирумамицина.

Изучение противогрибковых антибиотиков среди производных полиенов, олигомицинов, а также солей трисиндолилметилия - аналогов антибиотика турбомицина, позволило выявить закономерности "структура-активность", и провести направленную химическую модификацию этих препаратов. В результате получены антибиотики, превосходящие по своей активности in vitro и in vivo амф В.

Проведенные исследования позволяют заключить, что в поисковой работе необходим комплексный подход, направленный на проведение анализа свойств микробных продуцентов, совершенствование методов выделения и идентификации образуемых ими вторичных метаболитов, одновременное изучение как химических, так и биологических свойств выделяемых соединений с целью выявления основных закономерностей их механизма действия и взаимосвязи "структура - активность".

Таким образом, противоопухолевое действие солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, предстказанное на основании результатов, полученных в бактериальном тесте Я. salinarum, нашло свое подтверждение, а сам тест продемонстрировал свою пригодность к поиску противоопухолевых антибиотиков.

Вывод. Выделены и изучены микробные метаболиты - ИБС, обладающие гиполипидемическим и противогрибковым действием, принадлежащие к различным классам химических соединений. Выявлены препараты, подавляющие ранние и поздние этапы биосинтеза стеролов.

Получены новые сведения о гиполипидемическом действии аскофуранона и энниатина В. В микробных моделях показана способность антибиотика 1709 (группа амфомицина) к подавлению ранних, а у антибиотика 1132 (хлоротрицин) поздних этапов биосинтеза стеролов.

Выявлена высокая противогрибковая активность антибиотика 4883 (группа ирумамицина), позволяющая рассматривать этот препарат в качестве перспективного противогрибкового лекарственного средства.

В экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность свыше 60 производных полиеновых антибиотиков. Выявленные закономерности "структура-активность", позволили осуществить направленную химическую трансформацию препаратов. Получены соединения, превосходящие по своей активности в опытах in vitro и in vivo известный противогрибковый препарат амфогерицин В. ДМАЭ-амид S44HP (2) и его водорастворимая глутаматная соль (2G) отобраны для углубленного доклинического изучения.

В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкил;:ндол-3-ил)метилия -аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Наиболее активные производные, длина алкильной цели которых составляет С4-С5, превосхбдят по своей активности амфотерицин В.