Поиск молекулярно-генетических предикторов развития агрессивных лимфом

Выявление молекулярно-генетических маркеров развития и прогноза для опухолевых заболеваний крови составляет суть предиктивной онкогематологии, основной задачей которой является поиск доказательств диагностической ценности тех или иных генных полиморфизмов [3]. В качестве потенциальных маркеров исследуются гены различных систем клетки: метаболизма ксенобиотиков, апоптоза, цитокинов и др. Среди них большой интерес представляют гены фолатного обмена – важной биохимической системы клетки, влияющей на регуляцию экспрессии генов путем эпигенетической модификации ДНК (рис. 1). Метилирование CpG-островков в промоторе гена является нормальным процессом регуляции степени экспрессии генов в клетках. Гиперметилирование промоторов генов, которое связано с подавлением транскрипции, так же как и мутации, является механизмом инактивации классических генов-супрессоров опухолевого роста [12]. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолей встречается на ранних стадиях онкогенеза и прогрессивно увеличивается, что в конечном итоге приводит к злокачественной трансформации. Аберрантное метилирование ДНК и, как следствие, измененная экспрессия генов описаны при В-клеточных неходжкин-ских злокачественных лимфомах (НХЗЛ) [10]. Полимор- фные варианты генов фолатного цикла, которые влияют на метилирование ДНК, могут способствовать возникновению неходжкинских злокачественных лимфом, вызывая гипо- или гиперметилирование протоонкогенов и генов супрессоров опухолевого роста соответственно [11].

В связи с тем, что отмечается увеличение частоты агрессивных НХЗЛ в г. Новосибирске [5] актуально исследование однонуклеотидных замен (SNPs) в генах фолат-ного цикла как потенциальных молекулярно-генетических маркеров развития лимфоидных неоплазий.

Цель работы: изучить роль полиморфных локусов C677T и A1298C гена метилентетрагидрофолатредукта-зы ( MTHFR ), A2756G гена метионинсинтазы ( MTR ), A66G гена метионинсинтазыредуктазы ( MTRR ), G1958A гена метилентетрагидрофолатдегидрогеназы ( MTHFD1 ) и 844ins68 гена цистатион- β -синтазы ( CBS ) в формировании предрасположенности к развитию агрессивных НХЗЛ.

Материал и методы

Выборки. Группу обследованных составили 89 пациентов (46 мужчин и 43 женщины; средний возраст 49,4±14,2 года) Городского гематологического центра города Новосибирска с диагнозом агрессивной неходж-кинской лимфомы. Диагностика и лечение НХЗЛ прово-

Рис. 1. (адаптировано из [15]) Фолатный цикл: dTMP – тимидин; dUMP – уридин; THF – тетрагидрофолат; 5,10-methyleneTHF – 5,10-метилентетрагидрофолат; 5-methylTHF – 5-метилтетрагидрофолат; 10-formylTHF – 10-формилтетрагидрофолат; Met – метионин; Hcy – гомоцистеин; SAM – S-аденозилметионин; MTHFR – метилентетрагидрофолатредуктаза; SHMT – серилгидрокси-метилтрансфераза; MTHFD – метилентетрагидрофолатдегидрогеназа; MTR – метионинсинтаза; MTRR – редуктаза метионинсин-тазы; SHMT – серингидроксиметилтрансфераза; CBS – цистатионин- β -синтаза; Cystathionine – цистатионин

дилось согласно Российским клиническим рекомендациям по диагностике и лечению лимфопролиферативных заболеваний [1]. Вариант НХЗЛ оценивался согласно классификации лимфоидных неоплазий ВОЗ 2008 года. В-клеточные лимфомы имели 79 (88,8%) человек. Диффузная В-крупноклеточная лимфома диагностирована у 56 (71%) пациентов, анапластическая и мантийноклеточная – у 8 (10,1%) человек каждая, лимфобластная и фолликулярная 3-го цитологического типа – у 3 (3,8%) человек каждая, беркиттоподобная у 1 (1,2%) пациента. Т-кле-точные лимфомы диагностированы у 10 (11,2%) больных.

Контрольную группу составили 549 доноров Новосибирского центра крови, средний возраст обследованных 33,0 ± 11,01 лет.

Все пациенты подписывали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с требованиями этического комитета.

Генотипирование. ДНК выделяли из венозной крови с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК экстракцией примесей фенол-хло-роформом и осаждение ДНК этанолом; а также из буккального эпителия с использованием стандартной методики выделения ДНК на силике.

Определение генотипов полиморфных локусов G1958A гена MTHFD1 и 844ins68 гена CBS проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа. Определение полиморфных вариантов генов MTHFR, MTR, MTRR и SHMT1 проводилось методом ПЦР в режиме реального времени с использованием конкурирующих TaqMan-зондов, комплементар- ных полиморфной последовательности ДНК. Генотипирование осуществлялось по методике, описанной в [16].

Статистическая обработка данных. Частоты встречаемости аллелей и генотипов однонуклеотидных замен в генах фолатного цикла в выборке больных НХЗЛ сравнивали с таковыми в контрольной группе. Значимость различий оценивалась с помощью критерия χ2, статистически значимыми считались различия при р<0,05. Соответствие контрольной выборки равновесию Харди-Вайнберга также проверяли с помощью критерия χ2. Для оценки величины относительного риска использовали отношение шансов (OR) с его доверительным интервалом (C.I.) при уровне доверия 95%. Вычисления производились с помощью программы DeFinetti на сайте Института генетики человека (Мюнхен, Германия, . При оценке количественных признаков использовали вычисление средней арифметической (М) и ее ошибки (m).

Результаты

Исследованные SNPs имеют доказанное функциональное значение, т.е. изменяют активность, стабильность или количество соответствующих ферментов, что может привести к нарушению баланса между важнейшими метаболическими путями цикла фолиевой кислоты – синтезом dTMP и пуриновых нуклеотидов и метилированием ДНК, приводить к повреждению ДНК и, как следствие, инициировать онкогенез и обусловливать опухолевую прогрессию.

Таблица 1

Распределение аллелей и генотипов полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 в группе пациентов с агрессивными лимфомами

Аллели	Контроль	Больные ДВККЛ	OR	Больные ККЛ
Генотипы	1	2	С.I.	3
	Абс.             %	Абс.             %	P	Абс.            %
	n=539	n=54	ДВККЛ	n=27
G	544              50,5	76                 70	2,331	24              44
		p1–2< 0,0008	1,517–3,584	p1–3 > 0,05
		p2–3< 0,001	0,0008
A	534              49,5	32                30	0,429	30              56
		p1–2< 0,0008	0,279–0,659	p1–3 > 0,05
		p2–3< 0,001	0,0008
G/G	141                  26	27                 50	5,209	3                        11
		p1–2< 0,003	1,949–13,918	p1–3 > 0,05
		p2–3< 0,002	0,003
G/A	262               49	22                  41	0,439	18                 67
		p1–2< 0,006	0,241–0,798	p1–3 > 0,05
			0,006
A/A	136                25	59	0,192	6                  22
		p1–2< 0,003	0,072–0,513	p1–3 > 0,05
		p2–3< 0,002	0,003

При анализе частот аллелей исследуемых полиморфных локусов в общей группе агрессивных лимфом отмечено увеличение частоты дикого 1958G-аллеля гена MTHFD1 (64%) по сравнению с контролем (50,5%, p < 0,001), тогда как редкий 1958A-аллель в группе агрессивных НХЗЛ встречался реже: 36% против 49,5% (p < 0,001).

Из группы агрессивных НХЗЛ, с учетом наибольшей представленности, были выделены пациенты с диффузной В-крупноклеточной лимфомой (ДВККЛ, n=56). Отдельному анализу также подверглись больные с другими вариантами агрессивных лимфом (Т- и В-анапластичес-кой, Т и В-лимфобластной, беркиттоподобной, мантийноклеточной, фолликулярной 3-го цитологического типа, плеоморфной, n=33), преимущественно крупноклеточными (ККЛ).

Дикий 1958G-аллель MTHFD1 в группе больных ДВККЛ встречался чаще как по сравнению с группой контроля: 70% против 50,5% (p < 0,0008), так и с группой больных ККЛ, в которой частота 1958G-аллеля составила 44% (p < 0,001). В свою очередь, частота редкого 1958A-аллеля MTHFD1 в группе больных ДВККЛ составила лишь 30%, тогда как в группе пациентов с ККЛ – 56%, а в популяции г. Новосибирска – 49,5% (табл. 1).

Учитывая различия в распределении аллелей и генотипов в группе ДВККЛ, была проведена оценка риска развития данной группы неоплазий.

Для полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 выявлена сильная ассоциация редкого 1958A-аллеля со сниженным риском развития ДВККЛ (OR=0,429 C.I. [0,279– 0,659], p<0,0008, табл. 1), в то время как связи данной однонуклеотидной замены с другими вариантами агрессивных лимфом не обнаружено.

Объяснением полученным данным может служить то, что однонуклеотидная замена G1958A приводит к замене Arg653Gln в формилтетрагидрафолатсинтетазном домене фермента MTHFD и уменьшает его термостабильность и метаболическую активность [7]. Поскольку субстратом данного фермента является тетрагидрофолат, потенциально его накопление способствует повышению концентрации 5,10-метилентетрагидрофолата, что, в свою очередь, может увеличивать эффективность синтеза тимидилата и метилирования ДНК, тем самым препятствуя злокачественной трансформации (рис. 1). Подтверждением этому служит ряд исследований, указывающих на протективный эффект фолата (предшественника тетрагидрофолата) в отношении НХЗЛ [6, 9].

Анализ остальных исследуемых локусов системы фо-латного цикла ассоциации с агрессивными НХЗЛ в выборке жителей г. Новосибирска не выявил.

Заключение

Проведенное исследование выявило ассоциацию полиморфного локуса G1958A гена MTHFD1 с предрасположенностью к развитию диффузной-В-крупноклеточ-ной лимфомы, что позволяет рассматривать данный локус как потенциальный маркер для включения в панель

SNPs, вклад которых в развитие и прогноз неходжкинс-ких злокачественных лимфом у жителей Западно-Сибирского региона был показан ранее [2, 4, 13]. Рискометрия НХЗЛ – это первый этап работы, направленный на выявление молекулярно-генетических предикторов, которые могут использоваться в рутинной диагностике лимфоидных неоплазий. В дальнейшем необходимо продолжить исследование на большем объеме выборки с изучением биохимических механизмов, определяющих действие полиморфных локусов генов фолатного обмена на лимфо-могенез.