Поиск перспективных антигенных маркеров для дифференциальной серодиагностики атипичного пестивируса свиней

Введение. Атипичный пестивирус свиней (АПС) – это высоковариабельный РНК-вирус с одноцепочечным положительно-полярным РНК-геномом размером приблизительно 11– 12 kb, относящийся к роду Pestivirus семейства Flaviviridae [1].

В естественных условиях свиньи могут заразиться вирусом классической чумы свиней ( Pestivirus C ), вирусной диареей КРС 1-го и 2-го типов ( Pestivirus A и B ), пограничной болезнью овец ( Pestivirus D ), а также атипичным вирусом свиней ( Pestivirus K ). Кроме того, возможна коинфекция генетически различными пестиви-русами – вирус Бангованна ( Pestivirus F ) и вирус Линда ( Pestivirus L ) [2].

АПС может заражать домашних свиней и диких кабанов [3]. АПС вызывает неврологические нарушения у новорожденных поросят, снижает репродуктивную способность свиноматок и увеличивает смертность поросят до отъема [3]. Заболевание у поросят проявляется конгениталь-ным (врожденным) тремором (КТ) типа А-II, искривлением ног, в то время как у взрослых свиней может наблюдаться хроническая инфекция, но при этом они выделяют вирус [3]. При КТ типа A наблюдаются гистопатологические изменения головного и спинного мозга, при КТ типа В таких изменений не отмечают. КТ типа А, в свою очередь, подразделяется на пять подтипов (I–V): подтип A-I вызывается вирусом КЧС, подтип A-III считается генетическим дефектом самцов свиней породы ландрас, КТ A-IV – также наследственный тип патологии, которая проявляется гипомиелинизацией головного и спинно- го мозга свиней британской породы Saddleback, причиной КТ подтипа A-V служит отравление супоросных свиноматок трихлорфоном. На протяжении многих лет причина возникновения КТ A-II оставалась неизвестной [4]. АПС может передаваться горизонтально через ротоглотку, а также вертикально через плаценту [3].

Клинически здоровые свиньи могут играть важную эпидемиологическую роль в качестве переносчиков вируса [5]. По данным источникам [5, 1] смертность среди поросят, инфицированных АПС, достигает 10–30 %, что серьезно влияет на свиноводство.

Впервые АПС был идентифицирован в 2015 г. в США методом метагеномного секвенирования в рамках проекта по изучению генетического разнообразия вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней в образцах сывороток крови [6]. Так, ближайшими родственниками АПС являются Pestivirus S , обнаруженный у китайских летучих мышей ( Rhinolophus affinis, Scotophilus kuhlii ), в то время как Pestivirus R , обнаруженный у грызунов в Китае ( Apodemus draco, Apodemus peninsulae, Niviventer excelsior, Niviventer niviventer ) и Pestivirus J – обнаруженный в США ( Rattus norvegicus ) образуют филогенетически отдельную кладу [6].

АПС был выявлен на всех континентах, за исключением Африки и Австралии. Наибольшее разнообразие последовательностей на сегодняшний день обнаружено в Китае. Было предложено выделить три клады: клад I, клад II и клад III. Более того, штаммы клады I были дополнительно сгруппированы в четыре группы: подгруппу 1, подгруппу 2, подгруппы 3 и 4 [7].

В настоящее время распространенность АПС в России малоизучена и включает в себя лишь единичные исследования [4, 8]. Филогенетический анализ А.М. Аноятбековой и А.Г. Южакова в 2025 г. [8] показал, что российские изоляты отличаются друг от друга и распределяются по трем кластерам. Изоляты из Красноярского края, Белгородской, Томской, Курской областей и Республики Бурятия имеют высокую нуклеотидную идентичность (94,3–98,8 %) со штаммами из Венгрии, в то время как изоляты из Московской и Псковской областей имеют высокую нуклеотидную идентичность (89,2–94,3 %) со штаммами из США. Изолят из Республики Мордовия имеет высокую нуклеотидную идентичность (97,1 %) со штаммом из Южной Кореи.

Геном пестивирусов обладает линейной структурой, включающей 3'- и 5'-нетрансли- руемые области (UTR), фланкирующие одну длинную открытую рамку считывания (ORF). Порядок генов пестивирусов был определен как 5' – Npro, C, Erns, E1, E2, p7, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B – 3'. Установлено, что ген NS3 АПС высококонсервативен в китайских штаммах, в то время как гены NS5A, p7, NS2, Npro и Erns отличаются высокой вариативностью – менее 5 % аминокислот идентичны у всех известных пестивирусов [6, 9]. Гены C, E1, E2 и NS4A демонстрируют среднюю степень идентичности аминокислот, которая варьируется от 9 до 15 %. Erns (23 %), NS3 (29 %), NS4B (20 %) и NS5B (22 %) имеют самую высокую степень сохранения аминокислотной идентичности [6]. И у АПС, и у изолятов летучих мышей отсутствует почти весь двухцепочечный структурный домен гликопротеина E2 [6]. Белок E2 АПС не имеет двух N-концевых доменов. Поскольку белок E2 пестивирусов отвечает за посредничество в проникновении вируса в клетки, эта делеция может привести к различиям в проникновении вируса между АПС и другими пес-тивирусами [1].

Диагностика АПС основана на молекулярном выявлении вируса, поскольку на рынке отсутствуют коммерчески доступные тест-системы. Разработка универсального молекулярного анализа широкого спектра действия является сложной задачей, учитывая высокую генетическую изменчивость циркулирующих штаммов [10]. Праймеры, нацеленные на 5'-нетрансли-руемую область (UTR) генома пестивируса, реагируют как на АПС, так и на различные генотипы КЧС, что приводит к ограниченной специфичности [10]. Применяется мультиплексный анализ TaqMan [10], в котором используются флуоресцентно меченые зонды, предназначенные для областей NS3 и NS5b, однако обладающие сомнительной чувствительностью в связи с высокой вариабельностью штаммов АПС.

Размножение АПС считается крайне неэффективным в первичных клетках почки свиньи и перевиваемых линиях клеток свиньи (PK-15, IBRS-2, SK6 и ST) [1]. Таким образом, на сегодняшний день только один штамм АПС – Ger-NRW_L277 был успешно выделен и стабильно размножен на эпителиальных клетках эмбриональных почек свиньи (клетки SPEV) немецкой исследовательской группой [11].

Методы диагностики, применяемые в отношении АПС на данный момент, представлены в таблице 1.

Таблица 1

Метод	Маркер	Источник
Молекулярно-генетические методы
ОТ-ПЦР	NS3 и NS4B	Postel et al., 2016 [12]
	Е2	Liu J et al., 2021 [13]
	NS3 и NS5B	Yuan F et al., 2021 [14] Yuan J et al., 2017 [15]
	NS5A	Deng L et al., 2022 [16]
	Erns	Shi K et al., 2021 [17] Liu J et al., 2021 [13]
	5′ UTR	Liu H et al., 2023 [18]
Цифровая капельная ПЦР	NS5A	Deng L et al., 2022 [16]
Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)	NS3 и свиной убиквитин	Postel et al., 2016 [12]
Мультиплексный анализ TaqMan	NS3 и NS5b	Dénes et al., 2025 [10]
Серологические методы
ИФА	E2	Song H et al., 2024 [19] Arruda BL et al., 2022 [20]
	Erns	Postel et al., 2017 [11] Arruda BL et al., 2022 [20] Liu J et al., 2021 [13]
	NS3	Schwarz L et al., 2017 [21] Arruda BL et al., 2022 [20]
Реакция нейтрализации	Е2, Erns	Cagatay GN et al., 2019 [22]
Тест непрямой иммунофлуоресценции	Химерная конструкция вируса вирусной диареи крупного рогатого скота 1, содержащая последовательности АПС, кодирующие E1 и E2	Michelitsch A et al., 2019 [23]
Иммуногистохимический анализ	Е2	Liu J et al., 2021 [13]

Методы диагностики, применяемые в отношении АПС

Diagnostic methods used in relation to APPV

Кроме того, поскольку это заболевание имеет схожие проявления с КЧС, болезнью Ауески, цирковирусной инфекцией свиней и некоторыми другими заболеваниями, которые до сих пор являются эндемичными во многих странах, очень сложно точно дифференцировать и диагностировать их только на основании клинических признаков и патологических изменений [3]. Циркуляция атипичного пестивируса свиней в стадах может осложнить дифференциальную диагностику классической чумы свиней из-за некоторой схожести симптоматики [4]. К тому же использование коммерчески доступных ИФА-тестов к классическим пестивирусам (КЧС) непригодно для недавно обнаруженных атипичных пестивирусов из-за отсутствия перекрестной реактивности.

Меры контроля и вакцинация против АПС, вероятно, станут проблемой в будущем. Высокие показатели выявления АПС не только у домашних свиней, но и у диких кабанов являются сложной задачей для разработки эффективных мер борьбы [5].

Для эффективного мониторинга, профилактики и борьбы с АПС необходимы высокочувствительные и специфичные методы выявления данного заболевания. В России не описаны средства диагностики АПС как таковые, в связи с этим необходимо создание подобных тест-систем, позволяющих к тому же производить дифференциальную диагностику, что возможно с применением технологии рекомбинантных ДНК.

Цель исследования – поиск перспективных антигенных маркеров для дифференциальной серодиагностики атипичного пестивируса свиней.

Задачи: проведение биоинформационного анализа основных представителей рода Pesti-virus для выделения перспективных иммуногенных участков АПС.

Объекты и методы. В работе использовали последовательности штаммов и изолятов пес-тивирусов разных типов, депонированных в базе данных Национального центра биотехнологической информации Genbank (NIH, США) (табл. 2). Выбор штаммов и изолятов для анализа был обусловлен необходимостью охвата всего известного генетического разнообразия вирусов, входящих в род Pestivirus (семейство Flaviviridae). Приоритет отдавался полноразмерным геномным последовательностям (полная кодирующая последовательность), депони- рованным в базе данных GenBank, что позволило исключить влияние артефактов, связанных с фрагментарностью данных. Для обеспечения репрезентативности выборки в анализ включали: референсные штаммы, верифицированные Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV) для каждого официально признанного вида (таких как Pestivirus A – BVDV-1, Pestivirus B – BVDV-2, Pestivirus C – BDV, Pestivirus D – CSFV и др.); изоляты, демонстрирующие высокую степень генетической гетерогенности внутри видов, включая представителей различных субгенотипов (субтипов), географических регионов и лет изоляции; последовательности, полученные как от домашних, так и от диких животных (включая изоляты от свиней, крупного рогатого скота, овец), что позволило оценить межвидовой переход и филодинамику вирусов.

Таблица 2

Возбудитель	Штаммы (название, GenBank ID)
1	2
Вирус АПС ( Pestivirus K, Flaviviridae )	Клада 1: 000515 (ID KR011347.1), Bavaria S5/9 (KU041639.1), ISDVDL2014016573 (ID KU194229.1), APPV_GER_01 (ID LT594521.1), APPV-China/SWU-YB/2018 (ID MH499646.1), APPV-China/SWU-DY/2018 (ID MH499642.2), GD-HJ-2017.04 (ID MK216752.1), APPV/Pig-wt/USA/Minnesota-1/2016 (ID MF590069.1), AUT-2016_C (ID OK564403.1) Клада 2: China/HLJ491/2017 (ID OQ032517.1), APPV-China/GD-GL/2016 (ID MH221022.1), APPV-China/GD-SHT/2016 (ID MH221026.1), APPV-China/GD-ST/2016 (ID MH221027.1), APPV-China/GD-HE/2016 (ID MH221023.1), GD-YJHSEY2N (ID MK347475.1), GD-YJHSEY3N (ID MK347476.1) Клада 3: AH-GL-2017.04 (ID MK216749.1), AH-GL-2018.01(ID MK216750.1), GD-HJ-2017.04 (ID MK216752.1), GD-LN-2017.04 (ID MK216753.1), GD-ZW-2017.10 (ID MK216754.1), Annaka/2020 (ID LC596433.1) CHheb1701 (ID MH307700.1), APPV-SDHY-2022 (ID OP381297.1), USA/023005/2016 (ID MW183241.1), USA/047310/2017 (ID MW183242.1), APPeV/Sus scrofa/JAPAN/boar73/2019 (ID LC862289.1), AUT-2016_C (ID OK564403.1)

Окончание табл. 2

1	2
Вирус КЧС (Pestivirus C, Flaviviridae)	Генотип 1.1: Shimen (ID AY775178.2), CSFV-GZ-2009 (ID HQ380231.1), C-ZJ-2008 (ID HM175885.1), HEBZ (ID GU592790.1), Alfort/187 (ID X87939.1), HCLV (ID AF531433.1), Riems (ID AY259122.1) Генотип 1.2: Baker A (ID MZ643986.1) Генотип 1.3: CSF0650 (ID JX028200.1), CSF0306 (ID JQ411570.1) Генотип 1.4: csf0705 Margarita (ID jx028201.1), CSF1057 Santiago de Cuba (ID JX028203.1) Генотип 2: Eystrup (ID NC_002657.1) Генотип 2.1a: Paderborn (ID AY072924.1), Zj0801 (ID FJ529205.1), 96TD (ID AY554397.1) Генотип 2.1b: 0406/CH/01/TWN (ID AY568569.1), CSFV-JXNC01-2015 (ID KX064281.1), C/HVRI (ID AY805221.1) Генотип 2.1с: HNSD-2012 (ID JX218094.1), GXF29/2013 (ID KP233070.1), HNLY-2011 (ID JX262391.1) Генотип 2.1d: JSZL (ID KT119352.1), HuN23/2013 (ID KP233071.1) Генотип 2.2: Bergen (ID KJ619377.1), ND20 (ID MH979232.1), CSFV_IND/UK/LAL-290 (ID KC851953.1) Генотип 2.3: Alfort/Tüebingen (ID J04358.2), CSFV/2.3/dp/CSF864/2007/BG/Jambul (ID HQ148062.1), CSFV/2.3/dp/CSF0821/2002/HR/Novska (ID HQ148061.1) Генотип 3.4: 94.4/IL/94/TWN (ID AY646427.1), CSF0309 Kanagawa (ID JQ411571.1)
Вирус ВД КРС (Pestivirus A, B, Flaviviridae)	Генотип 1а: NADL (ID AJ133738), USMARC-55477 (ID KP941586.1), SD1 (ID M96751) Генотип 1b: Osloss (ID M96687) Генотип 1i: ACM/BR/2016 (ID KX857724.1) Генотип 1d: 10JJ-SKR (ID KC757383), BJ1201 (ID KT943518.1) Генотип 1h: UM/126/07 (ID LT631725) Генотип 1e: Carlito (ID KP313732) Генотип 1k: SuwanCp (ID KC853440.1) Генотип 1f: J (ID AF298067), W (ID AF298073) Генотип 2а: BVDV2_OV856 (ID PV541661.1), GS2018 (ID MN527354.1) Генотип 2b: BVDV 2b GX24 (ID PX682047.1), Hokudai-Lab/09 (ID AB567658.1),2b (ID PP854293.1), Mungyeong (ID ON676188.1) Генотип 2с: IT/2018_64643 (ID PX121312.1), IT/2016_169121 (ID PX121311.1), IT/2015_277457-2 (ID PX121310.1)
Вирус ПБО ( Pestivirus D, Flaviviridae )	Генотип 1: Moredun cp (ID U65022.1) Генотип 2: Casimir (ID AB122085.1), Rudolph (ID AB122086.1) Генотип 3: Gifhorn (ID KF925348.1), X818 (ID NC_003679.1) D29/00 (ID MT648677.1) Генотип 4: H2121 (Chamois-1) (ID GU270877.1) Генотип 5: Aveyron (ID KF918753.1) Генотип 6: RUPI-05 (ID KC859387.1), (ID 10F03356 KC859388.1) Генотип 7: LA/82/04 (ID FM163383.1) Генотип 8: Italy-58987 (ID MG649392.1)

Перечень штаммов, использованных для биоинформационного анализа List of strains used for bioinformatic analysis

Анализ консервативности эпитопов был проведен с помощью программы BLASTn (NCBI, NIH, США) на основе локального выравнивания генов против геномов представителей рода Pestivirus . Филогенетический анализ был проведен на основе полногеномных последовательностей в программе MEGA11 (Mega Software, США). Эволюционные дистанции между последовательностями рассчитывали методом максимального правдоподобия согласно двухпараметрической модели Kimura. Топологию филограмм оценивали на основании анализа 1000 псевдореплик; различия между кластерами считали достоверными, если индекс поддержки в узлах составлял не менее 70. Скрининг канди-датных пептидов проводили с использованием прогностических веб-серверов. Наличие линейных B-клеточных эпитопов определяли в программе BepiPred 3.0 при пороговом значении 0,5. Для оценки антигенного потенциала пептидов применяли инструмент VaxiJen v2.0 при пороговом значении 0,4 (для вирусных моделей). Участки, показавшие низкие значения (score) в обоих алгоритмах, из дальнейшего анализа исключались.

Результаты и их обсуждение

Формирование выборки и построение консенсусных последовательностей . Для исключения перекрестных реакций и обеспечения высокой чувствительности потенциального рекомбинантного диагностического белка на первом этапе исследования был проведен биоинфор-мационный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей четырех основных представителей рода Pestivirus: АПС (APPV/ Pestivirus K – представители трех основных клад, циркулирующих в Европе, Азии и Америке), вируса КЧС (CSFV/ Pestivirus C – представители 3 генотипов), вируса ВД КРС (BVDV/ Pestivirus A, B – представители 1 и 2 генотипов), вируса ПБО (BDV/ Pestivirus D – представители 8 генотипов). Для каждой группы вирусов с использованием алгоритма MUSCLE было выполнено множественное выравнивание. На основе полученных данных были сгенерированы четыре видоспецифичные консенсусные последовательности аминокислот. Генерацию консенсуса осуществляли при пороговом уровне идентичности (identity threshold) 75 %, что позволило исключить спорадические точечные мутации, характерные для единичных изолятов, и сформировать усредненный профиль наиболее стабильных участков протеома для каждого вида вируса.

Сравнительный анализ и поиск уникальных эпитопов. Полученные консенсусные последовательности АПС, вирусов КЧС, ВД КРС и ПБО были выровнены относительно друг друга. Поиск потенциальных антигенных мишеней проводился путем визуального и статистического анализа данных выравнивания. Отбор участков проводился по двум критериям: а) высокая консервативность внутри вида АПС (участок должен быть представлен идентичными аминокислотами у подавляющего большинства штаммов); б) низкая гомология с другими пестивиру-сами (выбранный участок протеома АПС должен иметь значимые отличия (делеции, инсер-ции или множественные аминокислотные замены) в гомологичных позициях у вирусов КЧС, ВД КРС и ПБО.

В результате сравнительного анализа полипротеинов четырех вирусов в качестве основной мишени для разработки структуры диагностического пептида был выбран поверхностный гликопротеин Е2. Данный выбор обоснован совокупностью структурных, иммунологических и биоинформационных факторов:

– Иммунодоминантность. Белок Е2 является основным иммуногеном пестивирусов, именно на него вырабатывается основной пул нейтрализующих антител, вырабатываемых организмом хозяина при инфицировании. Использование эпитопов Е2 в серологической диагностике обеспечивает высокую корреляцию с вируснейтрализующей активностью сыворотки, что критически важно для оценки иммунного статуса животных.

– Высокая межвидовая дивергенция. Данные выравнивания продемонстрировали, что белок Е2 является наиболее вариабельным участком полипротеина при межвидовом сравнении. В отличие от высококонсервативных неструктурных белков (например NS3 или NS5B), которые характеризуются высокой степенью гомологии между АПС и вирусом КЧС (что неизбежно привело бы к ложноположительным реакциям), последовательность Е2 АПС содержит уникальные гипервариабельные домены.

– Поверхностная локализация. Как структурный белок оболочки, Е2 экспонирован на поверхности вириона и доступен для распознавания иммунной системой в нативной конформации, это повышает вероятность, что синтетические линейные пептиды будут успешно имитировать нативные антигенные детерминанты.

На основе анализа консенсусных последовательностей пестивирусов в структуре поверхностного гликопротеина Е2 было предварительно локализовано 9 потенциальных эпитопных участков. Для подтверждения иммуногенных свойств отобранных кандидатов и исключения неспецифических последовательностей проводились in silico прогнозирование B-клеточных эпитопов, а также оценка общей антигенности пептидов и их способности индуцировать иммунный ответ (табл. 3).

Таблица 3

Идентичность и консервативность кандидатных пептидов в структуре гликопротеина Е2 АПС Identity and conservativeness of candidate peptides in the structure of the E2 APC glycoprotein

Последовательность пептида	Позиция в протеоме, а.о.	Протяженность, а.о.	Показатель BepiPred	Показатель VaxiJen
ISKGNLIGAIL	697–707	10	0,46 (не антиген)	-0,5561 (не антиген)
SCHKRQDYYSIQLVVDGKTGVEKRSIVGK	718–746	28	0,6 (антиген)	0,7946 (антиген)
TVITREGREPRLMEQISMVS	748–767	19	0,56 (антиген)	0,9019 (антиген)
DSLSETYCYNRLNTSSWG	835–852	17	0,59 (антиген)	0,2018 (не антиген)
RQPARQRGCGQTV	865–877	12	0,61 (антиген)	-0,5815 (не антиген)
WPGDNVLEEQYYSTGYWVNAT	880–900	20	0,39 (не антиген)	0,2367 (не антиген)
QLREGVWLSRKGNVQCQRNGSSLILQ	944–969	25	0,67 (антиген)	1,0591 (антиген)
LAIKEENDTMEIPCDPVETE	982–1001	19	0,54 (антиген)	0,8751 (антиген)
TQGTCVYSWAFAPRGW	1008–1023	15	0,53 (антиген)	0,4923 (антиген)

Здесь и далее: полужирным шрифтом выделены эпитопы, продемонстрировавшие потенциальную антигенность одновременно в двух прогностических моделях.

Проведенный сравнительный анализ консенсусных последовательностей гликопротеина Е2 пестивирусов показал наличие в протеоме АПС по меньшей мере 5 участков с высокой вероятностью антительного распознавания и одновременно с низкой степенью идентичности к гликопротеинам Е2 прочих пестивирусов. Эти участки представляют собой перспективные мишени для серологической диагностики, поскольку сочетание высокой предсказанной антигенности и межвидовой уникальности минимизирует риск перекрестных реакций с родоспецифичными антителами.

Также было установлено, что уникальные для АПС эпитопы присутствуют не только в структуре Е2, но также в структурах N-концевой протеазы (Npro) и оболочечного гликопротеина Е2. Учитывая ключевую роль Npro в подавлении интерферонового ответа и его экспрессию на ранних стадиях инфекции [24], такие эпитопы могут представлять интерес в качестве дополнительных серологических маркеров естественного инфицирования АПС. Гликопротеин Е1 совместно с Е2 участвует в формировании оболочки вириона и процессах взаимодействия с клеточными рецепторами, вовлекаясь в формирование гуморального иммунного ответа [25]. Уникальные эпитопы Е1 могут рассматриваться как перспективное дополне- ние к Е2-основанным антигенам. Характеристики дополнительных эпитопов, входящих в структуры Npro и E1, представлены в таблице 4.

Таблица 4

Идентичность и консервативность дополнительных кандидатных пептидов в структурах белков Npro и Е1 АПС

Identity and conservativeness of additional candidate peptides in the structures of Npro and E1 APPV proteins

Последовательность пептида	Позиция в протеоме, а.о.	Протяженность, а.о.	Показатель BepiPred	Показатель VaxiJen
В структуре белка Npro
KKEKQRNGWTELV	10-22	12	0,61 (антиген)	0,1725 (не антиген)
ESHTKITTLSGKTYRGTWEMEK- RPNPYGTYFPRPSPQQLTALHPHPVVN	25-73	48	0,51 (антиген)	0,7112 (антиген)
KVIEYKGTDPNYGDCPNTNGVFI	75-97	22	0,53 (антиген)	0,7670 (антиген)
GIWKIRLDYSDLIN	110-123	13	0,56 (антиген)	0,5580 (антиген)
SGELATVMLVHNRVLVEDCRGLYQ	142-165	23	0,59 (антиген)	0,0939 (не антиген)
В структуре белка Е1
ERSDTSCLRPPSTSWVRPVK-MDEASLADS	440-468	28	0,55 (антиген)	0,6353 (антиген)
EYGSEWLEHESLVTEGLIPG	601-621	20	0,59 (антиген)	0,1661 (не антиген)

В совокупности полученные данные указывают, что Npro и E1 являются перспективными источниками специфических эпитопов, которые могут быть использованы для создания комбинированных мультиэпитопных антигенов.

Наряду с уникальными для АПС эпитопами, проведенный анализ консенсусных последовательностей показал наличие протяженных высококонсервативных участков для всех исследованных пестивирусов. Эти участки локализованы преимущественно в неструктурных белках NS2 (1677-1784 а. о.), NS3 (1798–1875 а. о., 1925–2308 а. о.), NS5A (2680–2819 а. о.) и NS5B (3578–3821 а. о.), и идентичность отдельных участков составляет до 80 %. Данная картина хорошо согласуется с функциональной ролью перечисленных белков: NS3 и NS5B являются ключевыми ферментами репликационного ком- плекса (сериновой протеазой/геликазой и РНК-зависимой РНК-полимеразой соответственно), а NS2 и NS5A также участвуют в процессах по-липротеолитического процессинга [24, 26]. Высокая функциональная значимость этих белков накладывает жесткие эволюционные ограничения на допустимые аминокислотные замены, что проявляется в выраженной консервативности их отдельных доменов. С практической точки зрения такие консервативные участки не являются кандидатами для разработки АПС-специфичных диагностических антигенов, поскольку направленный на них иммунный ответ с высокой вероятностью будет перекрестным.

Таким образом, результаты сравнительного анализа аминокислотных последовательностей позволили выделить две принципиально разные группы мишеней: а) уникальные эпитопы струк- турных (Е2, Е1) и регуляторных (Npro) белков АПС, перспективные для включения в состав диагностического антигена; б) высококонсервативные фрагменты NS2, NS3, NS5A, NS5B, отражающие функциональные «ядра» реплика-ционных белков пестивирусов и потенциально пригодные для пан-пестивирусных подходов, но не для видоспецифичной серологической дифференциации.

Заключение. В отечественных источниках отсутствует информация об эпитопном составе АПС, в связи с чем мы определили участки с наиболее перспективными эпитопами, которые в дальнейшей будут использованы в дизайне антигенных маркеров для серологической диагностики АПС. В ходе проведенного анализа было установлено, что высокая генетическая дистанция гена, кодирующего белок Е2 АПС от такового КЧС и пестивирусов жвачных, делает этот белок идеальным кандидатом для разработки высокоспецифичного дифференциального диагностикума. В связи с этим целесообразно рассматривать конструирование рекомбинантного диагностического антигена в виде мультиэпитопного белка, объединяющего выявленные эпитопы Е2 АПС в синтетическую полипептидную цепь. Включение нескольких независимых антигенных детерминант в состав одного антигена потенциально позволит повысить чувствительность тест-систем за счет суммарного вклада эпитопов в связывание специфических антител, нивелировать влияние вариабельности по отдельным аминокислотным позициям внутри полевых штаммов АПС, а также сохранить высокую специфичность по отношению к АПС за счет низкой идентичности включенных фрагментов к Е2 других пестивирусов.

При разработке структуры подобного муль-тиэпитопного белка целесообразно располагать индивидуальные эпитопы в линейной последовательности, разделяя их короткими линкерами, что должно способствовать их доступности для антител в составе рекомбинантного антигена.

Мультиэпитопный конструкт на основе Е2 АПС может рассматриваться в качестве канди-датного антигена для разработки непрямого ИФА или ИХА, ориентированных на специфическое выявление антител к АПС в сыворотках свиней без перекрестного реагирования с антителами к классическим пестивирусам [27, 28].