Показатели аллогенных взаимодействий лимфоцитов супругов как дополнительные диагностические и прогностические критерии иммунных форм репродуктивных потерь

Адрес: 650099, г. Кемерово, ул. Весенняя, 13, кв. 22.

Тел.: +79045732443.

сыворотки, недостатком которых является использование радиоизотопных компонентов и сложность культуральных работ [2]. Функциональные особенности иммунокомпетентных клеток можно оценить по экспрессии поверхностных антигенов (CD, HLA) с помощью проточной цитометрии. Важной молекулой лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток является HLADR, которая участвует в презентации антигенов Т-лимфоцитам и является маркером активации иммунокомпетентных клеток. Обсуждается вопрос о том, что блокирующий эффект женской аутосыворотки осуществляется антителами, направленными к определенным эпитопам аллогенных HLA [3]. Эта поверхностная структура мононуклеаров может быть ключевой при цитометрическом исследовании иммунных взаимодействий аллогенных лимфоцитов супругов.

Цель : поиск новых лабораторных подходов для диагностики иммунных форм репродуктивных потерь на основе исследования аллогенных взаимодействий лимфоцитов супругов и влияния на этот процесс женской аутосыворотки.

Материал и методы. Для выполнения поставленной цели проведено ретроспективное исследование «случай — контроль». Обследованы 54 супружеские пары с идиопатическими репродуктивными потерями (в анамнезе 3 и более спонтанно прервавшиеся в сроки 4–8 недель беременности) и 47 супружеских пар, имеющих двух и более детей. Исследование выполнено в соответствии со стандартами Good Clinical Practice и принципами Хельсинкской декларации. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ГБОУ ВПО «КемГМА» Минздрава России, у всех участников исследования получено письменное информированное согласие.

Для изучения аллогенных взаимодействий лимфоцитов (полученных на градиенте плотности, равном 1,077) супругов и влияния на этот процесс женской аутосыворотки проводили цитометрическую оценку (Epics XL–MCL, Beckman Coulter, USA) экспрессии HLADR, CD3 на смешанных мононуклеарах супругов, предварительно сепарированных от дэбри-са по общему маркеру лейкоцитов — CD45. Исследования особенностей иммунного ответа в смешанных аллогенных мононуклеарах проводили как со стандартными ростовыми факторами (20%-ная эмбриональная телячья сыворотка — ЭТС), так и при добавлении женской аутосыворотки (20% — вместо ЭТС). Инкубацию смешанных лимфоцитов проводили в концентрации 2000 клеток/мкл в полной среде RPMI (Hepes и глутамин) с добавлением до 20% ЭТС или женской аутосыворотки при температуре 370С. В аналогичных условиях выполняли инкубацию монокультур мононуклеаров супругов. Экспрессия HLADR в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) и в монокультурах отдельно женщины и мужчины, предварительно сепарированных по экспрессии CD45 из смешанных аллогенных мононуклеаров, а также эффект женской аутосыворотки на СКЛ супругов показаны на рис. 1.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.1, лицензионное соглашение BXXR006B092218FAN11. Силу ассоциации анализируемых признаков определяли с помощью величины отношения шансов (OR), которую высчитывали по модифицированной формуле для малых выборок. Для OR рассчитывали доверительный интервал (Cl) при 95%-ном уровне значимости. Если OR был равен 1, то считали, что ассоциация отсутствует. Если RR был меньше 1, считали ассоциацию отрицательной; если OR был больше 2, то ассоциацию считали положительной [4]. Проверка статистической значимости различий между относительными частотами двух или большего числа событий осуществлялась при помощи критерия Пирсона χ². Если сумма частот была небольшой, то использовался точный критерий Фишера. При проверке нулевых гипотез критическое значение уровня статистической значимости принималось равным 0,05. В случае превышения достигнутого уровня значимости

Рис. 1. Экспрессия HLADR на лимфоцитах в СКЛ с эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота (СКЛэ), в СКЛ с женской аутосывороткой и в контрольных спонтанных культурах лимфоцитов мужчины (мужа) и женщины (жены)

• (р) статистического критерия этой величины принималась нулевая гипотеза.

Результаты. Проведенное исследование показало (рис. 2), что экспрессия в смешанных аллогенных мононуклеарах супругов маркерного фенотипа CD45+/CD3+/HLADR+ (активированные Т-лимфоциты) была сопоставима в реакциях с ЭТС и с женской аутосывороткой в семейных парах как с репродуктивными потерями, так и имеющих детей (p>0,05). В то же время экспрессия фенотипа маркерного для В-лимфоцитов и макрофагов (CD45+/ CD3-/HLADR+) была различима в сравниваемых группах. Так, в группе семей, имеющих детей, экспрессия фенотипа CD45+/CD3-/HLADR+ достоверно снижалась при добавлении в реакционную смесь аллогенных мононуклеаров супругов женской аутосыворотки (2,21+0,76% против 9,57+2,22% с ЭТС, p<0,05). В группе же семей с репродуктивными потерями экспрессия этого фенотипа была сопоставима между смешанной реакций аллогенных моно-нуклеаров с добавлением ЭТС и с внесением в нее женской аутосыворотки (p>0,05). Рассматривая экспрессию этих двух фенотипов (CD45+/CD3+/HLADR+ и CD45+/CD3-/HLADR+) на смешанных аллогенных мононуклеарах с позиции значимости данного феномена в диагностике причин репродуктивных потерь, определяли величину OR. Показана прогностическая значимость этой величины для фенотипа В-лимфоцитов и макрофагов: CD45+/CD3-/HLADR+ (OR=0,19; p<0,05).

На следующем этапе работы проведено исследование активности женской аутосыворотки в клеточных реакциях смешанных аллогенных мононуклеа-ров (рис. 3).

При исследовании процента активации или подавления женской аутосывороткой экспрессии клеток с фенотипами CD45+/CD3+/HLADR+ (активированные Т-лимфоциты) и CD45+/CD3-/HLADR+ (А-мононуклеары) в смешанных аллогенных моно-нуклеарах (по отношению к экспрессии этих фенотипов в реакции с ЭТС) выявили следующую закономерность. В группе семей с репродуктивными потерями под воздействием женской аутосыворотки число клеток, экспрессирующих фенотип CD45+/ CD3+/HLADR+ (активированные Т-лимфоциты), увеличивалось на 87%, что составило общую активность женской аутосыворотки, равную 187%. В группе сравнения (имеющих детей), напротив, под воздействием женской аутосыворотки число клеток, экспрессирующих фенотип CD45+/CD3+/HLADR+ (активированные Т-лимфоциты), снижалось на 21% и в целом составило 79%. Получена достоверно значимая разница между активностью женской аутосыворотки в отношении клеток CD45+/CD3+/HLADR+ в семьях с репродуктивными потерями и в семьях, имеющих детей (187+19,3% против 79+11,5% соответственно, p<0,05). При исследовании данного феномена на клетках с фенотипом CD45+/CD3-/ HLADR+ достоверных различий между основной группой и группой сравнения не получено (p>0,05). Рассматривая данный феномен с позиции поиска новых диагностических критериев иммунных форм репродуктивных потерь, выявили, что для уровня активности женской сыворотки в отношении клеток с фенотипом CD45+/CD3+/HLADR+ получен достоверно значимый результат по показателю отношения шансов (OR=3,7; p<0,05).

Обсуждение. Проведенное исследование позволяет предположить, что физиологическое вына-

Рис. 2. Экспрессия маркеров CD45, CD3 и HLADR на смешанных аллогенных мононуклеарах в семейных парах с репродуктивными потерями (опыт) и в семейных парах, имеющих детей (контроль)

Рис. 3. Влияние женской аутосыворотки на клеточные реакции (экспрессия маркеров CD45, CD3, HLADR) в смешанных аллогенных мононуклеарах супругов в семейных парах с репродуктивными потерями (опыт) и в семейных парах, имеющих детей (контроль)

шивание беременности связано с подавлением факторами женской аутосыворотки иммунных реакций, в которых принимают участие антиген-представля-ющие клетки (А-клетки): В-лимфоцита, макрофаги, дендритные клетки. Супрессия по данной субпопуляции мононуклеаров биологически целесообразна, так как снижение экспрессии HLADR на А-клетках увеличивает толерантность иммунного материнского микроокружения в отношении полуаллогенного зародыша [5]. С другой стороны, избирательное уменьшения пула мононуклеаров, экспрессирующих HLADR, но не экспрессирующих CD3 по отношению к субпопуляции CD3+HLADR+, указывает на дифференцированное воздействие антител к HLADR и/или на их эпитопную разницу в рамках одной молекулы HLADR. Возможно, именно этот феномен вносит элемент «сумбурности» в значимость определения у женщин предсуществующих антиHLADR антител для диагностики иммунных форм репродуктивных потерь.

Проведенное исследование показало, что уровень экспрессии CD3 и HLADR на CD45+ смешанных аллогенных мононуклеарах супругов может быть диагностически значимым критерием для выявления иммунных причин репродуктивных потерь. Важным прогностическим критерием для этой формы репродуктивной патологии является и активность факторов, находящихся в женской аутосыворотке, в отношении экспрессии HLADR на клетках CD3+ и CD3-.

Выводы:

• 1.    При иммунной форме репродуктивных потерь наличествует повышение клеток уровня А-мононуклеаров, экспрессирующих HLDR, что способствует отмене толерантности к аллоантигенам зародыша и иммунному прерыванию беременности.

• 2.    При репродуктивных потерях женская аутосыворотка положительно влияет на активацию Т-лимфоцитов (CD3+/HLADR+), что может приводить к киллингу полуаллогенного зародыша.

• 3.    Уровень экспрессии CD3 и HLADR на CD45+ смешанных аллогенных мононуклеарах супругов может быть диагностически значимым критерием для выявления иммунных причин репродуктивных потерь.