Показатели иммунитета у больных с терминальной стадией почечной недостаточности и уремический токсин пара-крезол (обзор литературы и собственные исследования)

экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 16 лагающим к возникновению инфекционного процесса при ХПН, являются дефекты функционирования Т-и В-лимфоцитов, которые приводят больных, находящихся на гемодиализе, к неадекватной реакции на вакцинацию и инфекции [10].

Оксидативный стресс и воспалительная реакция связаны с активацией врожденного иммунитета, и необходимы для запуска приобретенного (адаптивного) иммунитета [11]. При физиологических условиях, после формирования приобретенного Т- и В-клеточного иммунитета и включения эффекторных механизмов защиты, запускаются регуляторные механизмы, в частности активируются регуляторные супрессорные Т- и В-лимфоциты, которые полностью прекращают активацию всех звеньев иммунитета, в том числе и воспаления. По данным литературы известно, что при ухудшении функции почек в организме больного повышается активность оксидативного стресса и воспаления [12, 13].

При ХПН имеется прямая взаимосвязь между накоплением в крови пациентов уремических токсинов и следующих биомаркеров оксидатив-ного стресса: продукты глубокого окисления белков (advanced oxidative protein products, AOPP), активность миелопероксидазы, и показатели активности воспалительного процесса (С-реактивный белок и провоспали-тельные интерлейкин-1 и интерлейкин-6) [14].

Постоянная активация иммунной системы при уремии приводит к хронизации воспалительного процесса и возникновению атеросклероза, с поражением сердечно-сосудистой системы [15].

Источником продуктов оксида-тивного стресса, а также провоспали-тельных интерлейкинов являются фагоцитарные клетки крови, в первую очередь активированные полиморфоноядерные лейкоциты и моноциты. Эти клетки не только фагоцитируют все чужеродное, но и распознают молекулярные структуры антигенов (паттерны), не характерные для собствен- ного организма [16]. В ходе фагоцитоза клетки активируются, в них образуются и накапливаются окисленные формы кислорода и различных радикалов, участвующих в оксидативном стрессе. Одновременно с фагоцитозом происходит распознавание чужеродных молекулярных структур через соответствующие паттерн-распознаю-щие рецепторы врожденного иммунитета, которые находятся как на поверхности (Толл-рецепторы-TLR), так и в цитоплазме этих клеток [16]. Результатом такого распознавания является запуск продукции провоспалитель-ных интерлейкинов-интерлейкина-1(ИЛ-1), интерлейкина-6 (ИЛ-6), фактора некроза опухоли альфа (ФНО-альфа) – активаторов системного воспаления [17].

У больных, находящихся на гемодиализе, повышена экспрессия TLR2 иTLR4 на моноцитах и TLR4 на нейтрофилах, что сопровождается увеличением продукции цитокинов в ответ на активацию TLR 4 липополисахаридами [17].

Известно, что активированные фагоцитарные клетки запускают не только системное, но и местное воспаление. Так, на поверхности моноцитов и макрофагов находятся рецепторы – ловушки (скавэнджер-ре-цепторы, CD36), с помощью которых эти клетки очищают ткани и сосуды, на которых сформированы атеросклеротические бляшки из окисленных липопротеинов. При этом моноциты и макрофаги активируются, и участвуют в запуске местного воспалительного процесса [18].

При уремии наблюдается одновременное повышение концентрации маркеров гликирования и оксидатив-ного стресса, что приводит к накоплению продуктов деградации белков и липидов, как в сосудистом русле, так и в тканях, в частности в интиме сосудов [19]. Активация механизмов распознавания моноцитами и макрофагами окисленных продуктов в тканях приводит к постоянной самоактивации воспалительного процесса у больных с ХПН [20].

Персистирующее системное и местное воспаление становится основным фактором риска нарастания тяжести этого заболевания [21, 22, 23]. Следует подчеркнуть, что спонтанная воспалительная активность клеток врожденного иммунитета при уремии сопровождается снижением их защитных противомикробных функций, а именно фагоцитарной (лейкоциты и макрофаги) и антиген-представляющей (дендритные клетки), что приводит к формированию ИДС при ХПН.

Таким образом, разработка методов уменьшения активности воспалительной реакции может стать новым способом лечения хронической болезни почек и нарастания ХПН, а также предотвращением развития ИДС [24-27].

Развитие «окислительного взрыва» в нейтрофилах в ответ на стимуляцию патогенами (прайминг лейкоцитов), является одним из основных механизмов врожденной иммунной защиты, за которым следует активация адаптивного иммунитета [28]. Прай-минг лейкоцитов оказывает влияние на их жизнеспособность путем торможения процесса конституционального апоптоза [29]. Накопление уремических токсинов и хронический гемодиализ приводят к спонтанной активации нейтрофилов и возникновению порочного круга «оксидативный стресс – воспаление», с одновременным подавлением иммунологических функций у больных с ХПН [21].

При уремии инвазия микроорганизмов может привести к развитию инфекционного заболевания. Инкубация лейкоцитов здорового человека с плазмой уремического больного или содержимым диализного мешка при перитонеальном диализе, приводит к спонтанной активации показателей оксидативного стресса и позволяет предположить, что в плазме уремического больного накапливаются соединения способные влиять на процесс праймирова-ния. И наоборот, спонтанный «окислительный взрыв» нейтрофилов уремического больного прекращается при введении плазмы крови здорового человека и полностью останавливается при воздействии фактора активации тромбоцитов [30].

Применение гемодиафильтрации, в отличие от гемодиализа, отменяет развитие спонтанной активации нейтрофилов. Это говорит о том, что гемодиафильтрация способна вывести из организма целый ряд соединений, вызывающих спонтанный оксидативный взрыв в этих клетках [31].

При ХПН чрезмерная воспалительная активация клеток врожденного иммунитета приводит к формированию ИДС. В этой ситуации для разрешения воспаления организму необходима координация механизмов удаления спонтанно активированных полиморфоядерных лейкоцитов [31]. С одной стороны, увеличение скорости апоптоза вызывает уменьшение иммунного ответа, с другой – её уменьшение и замедление процесса удаления постапоптотиче-ских лейкоцитов макрофагами приводит к воспалению [32, 33]. Таким образом, необходимо сохранение баланса между про- и антиапоптоти-ческими факторами [34]. В этой ситуации крайне важен характер «микроокружения» и сбалансированная концентрация соединений, модулирующих лейкоциты в месте воспаления. Внеклеточный ацидоз тормозит апоптоз, а внутриклеточное закисление среды лейкоцитов на фоне низкой концентрации бикарбоната в плазме крови гемодиализных больных приводит к его замедлению [27]. Гемодиализ нормализует апоптоз полиморфоядерных лейкоцитов [35-43]. ИДС при ХПН формируется не только в результате высокой про-воспалительной активности нейтрофилов, со снижением их функциональной активности, но и в результате изменения активности других клеток, принимающих участие в иммунном ответе.

Моноциты у больных на гемодиализе имеют все признаки стареющих клеток, обладающих повышенной склонностью к апоптозу

[35-38]. Учитывая, что одна из субпопуляций антигенпредставляющих дендритных клеток происходит из моноцитов, становится очевидным нарушение формирования специфического иммунного ответа, из-за недостаточности моноцитарных дендритных клеток. Апоптоз моноцитов снижается и переходит в нормальное состояние только при перитонеальном диализе. В этом смысле перитонеальный диализ имеет преимущество перед гемодиализом [43, 44].

У больных с ХПН вследствие повышения апоптоза лимфоцитов наблюдается В-клеточная лимфопения [39]. Т-клетки при ХПН находятся в состоянии ранней абберант-ной активации, за которым следует стадия их перехода в апоптотичес-кое состояние. Следовательно, В- и Т-клеточная лимфопения являются отражением снижения функциональной активности гуморального и клеточного иммунитета при ХПН, с высокой степенью риска возникновения инфекции [40]. При использовании диализаторов с низкопроницаемыми мембранами наблюдается более высокая степень апоптоза лимфоцитов, чем с применением диализаторов с высокопроницаемыми мембранами [42].

Таким образом, накопление в организме больного с терминальной стадией ХПН большого количества соединений, которые у здоровых людей выводятся почками, приводит к развитию уремического синдрома. На этом фоне происходит спонтанная воспалительная активация клеток врожденного иммунитета, повышается апоптоз моноцитов, из которых образуются антиген представляющие дендритные клетки, Т- и В-лимфоцитов – клеток формирующих специфический иммунный ответ, что приводит к формированию ИДС [45].

Уремический токсин пара-крезол

В 2003 году Европейская группа по уремическим токсинам опубликовала список 90 наиболее известных токсинов [45]. В 2012 году этот список был не только расширен, но и была опубликована информация об их нормальных и токсических концентрациях, оказывающих влияние на различные биологические функции организма больного. В список этих токсинов входит и пара-крезол (п-крезол) [46].

В последнее время среди работ, посвященных исследованию уремических токсинов, большое место занимает именно это соединение [47-49]. Показано, что в организме оно существует в основном в виде трех почти полностью связанных с альбумином соединений: п-крезола, п-крезол сульфата и глюкуронида – конъюгированного соединения, которое определяется в очень небольших количествах [50]. Установлено, что существует прямая зависимость между продукцией п-крезола и образованием конъюгатов. Считают, что проявление токсического эффекта этих соединений может отражать определение содержания общего п-крезола, который образуется после кислотного гидролиза плазмы в результате высвобождения из связанного состояния с альбумином материнской субстанции и конъюгатов в деконъюгированном состоянии [51]. Из литературы известно, что п-кре-зол тормозит функцию лейкоцитов, ингибируя «окислительный взрыв» у стимулированных клеток [52,53]. Он обладает способностью тормозить воспаление и противобактери-альную защиту, подавляя вызванную цитокинами экспрессию молекул адгезии на эндотелии, нарушая тем самым миграцию лейкоцитов в очаг воспаления [54]. Согласно мнению J.T. Jr. de Carvalho и соавт. [53] накопление п-крезола является прогностическим фактором возникновения инфекционного процесса у больных с ХПН.

Таким образом, ХПН характеризуется расстройством функции как врожденного, так и адаптивного иммунитета, что приводит к комплексному нарушению работы иммунной системы. В тоже время механизм раз- экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 16 вития и предикторы грозного инфекционного осложнения, в организме больного с ХПН до конца не исследованы, что требует дальнейшего изучения.

Целью настоящего исследования было сравнительное изучение состояния иммунитета больных с терминальной стадией почечной недостаточности на фоне гнойно-воспалительных осложнений и без них, и его взаимосвязи с концентрацией п-крезола.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

С целью выявления ранних изменений, связанных с развитием иммунодефицитного состояния у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, было выполнено иммунологическое обследование пациентов. Больные были разделены на две группы. I группа включала 6 больных с наличием гнойного воспалительного процесса в области сосудистого доступа, вo II группе, состоящей из 7 человек, не было гнойных осложнений. Группу контроля составили здоровые доноры. Гемодиализ проводили три раза в неделю, в течение 6 месяцев до проведения исследования. Кровь у больных, находящихся на гемодиализе, исследовали через три дня после очередной процедуры и брали в объеме 10 мл в пробирки с гепарином.

Исследование состояния врожденного иммунитета включало:

а) изучение функциональной активности нейтрофилов крови в тесте НСТ (тест восстановления нитросинего тетразолия) [55]; б) определение выделения цитокинов в системе ин витро (ИЛ-1b, ИЛ-6, ФНО-альфа) в сыворотке и в культуральной среде, на основе среды Игла (ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН имени М. П. Чумакова») без антибиотиков с 0,6% L-глутамином и буферным раствором HEPES под действием липополисахарида (ЛПС), («Sigma»).

Для проведения теста был использован нитро-синий тетразолий-НСТ (“Sigma”, с мол.весом 817,6), в концентрации 1 мг на 2 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ, рН 7,2-7Ю4). Для стимуляции нейтрофилов использовали 0,05% раствор опсонизированного Зимозана А (Sigma»). Учет результатов проводили под световым микроскопом (х100), путем определения процентного содержания активированных нейтрофилов с голубой «вуалью» или синими вкраплениями (диформазана) на 100 лейкоцитов.

Количественные и функциональные исследования Т- и В-клеточ-ного иммунитета.

• А.    Количественное исследование показателей субпопуляций Ти В-лимфоцитов, а также НК-клеток, НК-Т клеток, активированных Т-лимфоцитов исследовали с использованием моноклональных антител методом проточной цитометрии, на двухлазерном проточном цитофлуориметре FACSCaliber (Becton Dickin-son,BD)[56]). Полученные в ходе исследований данные подвергались компьютерному анализу на базе программного пакета CellQUEST (BD Biosciences). Перед началом работы аппарат проходил калибровку с применением коммерческого набора калибровочных микросфер Calibrate Beads.

• В.    Функциональные исследования Т-лимфоцитов проводили в системе in vitro, после культивирования клеток, выделенных из крови больных в градиенте плотности фиколл-веро-графина (р1,077), с использованием ФГА (фитогемагглютинин, ”Sigma”) – поликлонального активатора Т-лимфоцитов.

В некоторых исследованиях изучали влияние аутологичной сыворотки на активацию клеток пациентов с ХПН, для чего их культивировали в течение 24 часов с добавлением аутологичной сыворотки, в конечной концентрации 20%. В культуральных супернатантах через 24 часа исследовали цитокины-ИЛ1b,

ФНО-альфа, ИЛ-6, ИЛ-2, а также рецепторный антагонист ИЛ1-Ra методом твердофазного ИФА. Были использованы наборы для количественного твердофазного ИФА (ELISA) фирмы «Bender Med Systems» (Австрия). Ил1-Ra определяли с использованием ИФА тест системы-Quantikine R&Dsystems,Abingdon,Great Britain. Чувствительность определения ИЛ-1b составляла 10,0 пг/мл; ИЛ-6-15 пг\мл; ИЛ-2 -10,0 пг/мл; ФНО-альфа общего -25,0 пг/мл., Ил1-Ra-14пг/мл. Учет результатов проводили на микропланшетном спектрофотометре ELx808 фирмы «Biotek» (США) при длине волны 450 нм. Через 24 часов культивирования также изучали активацию лимфоцитов. Клетки после культивирования отмывали ФСБ (рН7,2-7,4), и окрашивали с использованием моноклональных антител к активационным маркерам Т-лимфоцитов-CD3+CD25+. Часть клеток культивировали 72 часа и затем методом проточной цитометрии определяли на них экспрессию CD71 - маркера пролиферации, и СD95 - маркера апоптоза.

При исследовании концентрации сывороточных иммуноглобулинов – IgG, А, М использовались наборы для количественного непрямого твердофазного ИФА- «Serazym Human IgM, IgG, IgA»(Seramun Diag-nostica, GmbH).

Количественное определение n-крезола проводили по модифицированному методу T. Niwa [47].

Результаты, полученные в ходе проведенных исследований, были обработаны с помощью прикладного пакета программ SPSS Statistics IBM Company. В качестве основного критерия был использован параметрический критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

При определении концентрации п-крезола в крови больных с терминальной ХПН было установлено, что у лиц с гнойными осложнениями I группы, его содержание составило 68 ± 9,3 мкмоль/л., во II группе – 48 ± 8,7 мкмоль/л., в контрольной группе-6,8 ± 3,4 мкмоль/л (рис.1).

Рис.1. Концентрация пара-крезола в крови лиц с нормальной функцией почек и больных с терминальной ХПН с гнойными осложнениями и без них. * Р<0,0001 по сравнению со здоровыми донорами # Р=0,0021 между 1 и 2 группами больных.

При исследовании показателей врожденного иммунитета, было показано, что в I и II группах величины спонтанной активации нейтрофилов в тесте НСТ составляли от 39-43%, по сравнению с контролем, где этот показатель был равен 10%, что может свидетельствовать об активности воспалительного процесса.

При анализе данных, полученных для стимулированной активации нейтрофилов в тесте НСТ, была выявлена разница этого показателя у пациентов I и II групп. В I группе наблюдалось снижение процентного содержания активированных нейтрофилов до 32%, по сравнению с контролем, где доля этих клеток был всегда выше 45%. Во II группе пациентов показатели стимулированного теста НСТ были выше 40% (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что у пациентов обеих групп, согласно данным спонтанного НСТ, наблюдается активация воспалительной активности лейкоцитов. При этом в I группе уменьшение показателя стимулированного НСТ, по сравнению с контрольной группой, свидетельствует о снижении функциональной активности нейтрофилов.

Таким образом, в I группе больных с большим содержанием паракрезола в крови, на фоне повышенной неспецифической воспалительной активности лейкоцитов, наблюдается снижение их функциональной активности.

К другим важным клеточным показателям врожденного иммунитета, относится оценка функции моноцитов. В нашей работе воспалительную функцию моноцитов оценивали по продукции интерлейкинов в системе in vitro при культивировании в течение 24 часов с ЛПС (50мкг/мл). В супернатантах культур исследовали провоспалительные цитокины-. ИЛ-1b, ИЛ-6, ФНО-альфа. Выявлено, что во всех группах, в том числе у здоровых доноров, под действием стимуляции ЛПС наблюдается клеточная выработка этих цитокинов. Не было выявлено достоверных различий и при определении противовоспалительного рецепторного антагониста интерлейкина (ИЛ-1Ra) (табл. 1).

Следующим этапом была проведена модификация культуральной среды, при этом клетки больных пациентов с ХПН и клетки здоровых доноров культивировали с добавлением аутологичных сывороток, в конечной концентрации 20%. Для контроля клетки больных с ХПН культивировали также с добавлением сывороток здоровых доноров не содержащих уремических токсинов. После модификации культуральной среды была выявлена разница между выработкой исследуемых интерлейкинов. По сравнению с группой здоровых доноров, у больных из I и II групп наблюдалась повышенная выработка ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-альфа. При этом показатели концентрации исследуемых интерлейкинов у пациентов I группы (с более высоким содержанием в сыворотке п-крезола) несколько превышали исследуемые показатели у пациентов II группы (табл.1). Добавление сыворотки здоровых доноров к клеткам больных с ХПН не вызывало повышение выработки провос-палительных интерлейкинов. Повышенная выработка ИЛ-1 может объясняться активацией инфламмосом-при одновременным воздействием ЛПС через СD14 и TLR4 моноцитов с одной стороны, и влиянием высокой концентрации уремических токсинов в аутологичных сыворотках. Это подтверждается тем, что сыворотка здоровых доноров не оказывает усиливающего эффекта на продукцию про-воспалительных интерлейкинов клетками тех же больных больных с ХПН.

Таким образом, у больных I и II групп с повышенным уровнем п-кре-зола в присутствии аутологичных уремических сывороток, наблюдается повышенная продукция моноцитами воспалительных ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-альфа. В тоже время по сравнению со здоровыми донорами, концентрация противовоспалительного рецепторного антагониста ИЛ-1Ra была снижена в обеих группах обследуемых больных ХПН (табл.1).

Наши результаты позволяют предположить, что п-крезол и другие сывороточные уремические токсины, которые не удаляются в процессе гемодиализа, усиливают продукцию моноцитами провоспалительных интерлейкинов, а также подавляют образование противовоспалительного ИЛ-1Ra.

Таким образом, исследование клеточных показателей врожденного иммунитета лейкоцитов и моноцитов у больных с ХПН, показало роль повышенной концентрации п-крезола в спонтанной активации воспалительной активности этих клеток, с одновременным снижением функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов. Возможно, что одним из механизмов поддержания спонтанной воспалительной активности клеток врожденного иммунитета у этих больных может являться нарушение продукции противовоспалительных антагонистов, в частности снижение выработки ИЛ-1Ra.

При изучении клеточного иммунитета оказалось, что количество Т-, В- и НК-клеток было неоднородно в обеих группах (табл. 1). В тоже время в I группе больных, по сравнению с контрольной группой, чаще выявляли снижение абсолютного содержания лимфоцитов, что сопровождалось снижением абсолютного содержания зрелых CD3+Т-лимфоцитов, а также экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 16

Таблица 1. Основные показатели иммунитета в исследуемых группах больных

Параметры	Больные находящиеся на гемодиализе с гнойными осложнениями		Больные находящиеся на гемодиализе без гнойных осложнений	Здоровые доноры	Достоверность различия
Показатели воспалительной и функциональной активности нейтрофилов в тесте НСТ больных с ХПН, находящихся на гемодиализе
Показатели спонтанного НСТ (воспалительная активность) %		39±5	32±6	10±4	ри <0,05 ри <0,05
Показатели стимулированого НСТ (функциональная активность) %		32±7	48±9	45±3	ри <0,05 рт <0,05
Концентрация интерлейкинов		в культуральной среде через 24 часа без добавления аутологичной сыворотки
ИЛ-lb пг/мл		203±56	222±61	191±52	ри» <0,05 ри <0,05
Ил1-Ra пг/мл		513±85	511±97	487±84	ри <0,05 ри <0,05
Ил-6 пг/мл		798±97	833±122	810±83	ри <0,05 р и-111 <0,05
ФНО-альфа пг/мл		175±83	151±65	121±55	р і -111 <0,05 р и-и \1 <0,05
Концентрация интерлейкинов		в культуральной среде через 24 часа с добавлением аутологичной сыворотки
ИЛ-lb пг/мл		304±52	233±49	193±49	р і -111 <0,05 р ।-11 <0,05
Илі-Ra пг/мл		361±55	411±60	497±48	р і -і і і <0,05 р и-і11 <0,05
Ил-6 пг\мл		953±111	887±82	793±55	р і -111 <0,05 р іі -і11 <0,05
ФНО-альфа пг/мл		319±87	284±73	121±52	рі -111 <0,05 р и-і \1 <0,05
Изменения в		иммунограммах больных с ХПН, находящихся на гемодиализе
Абсолютное содержание лимфоцитов (кл/мкл)		905±152	955±212	1210±221	р і -і і і <0,05
CD3+		711±149	850±180	997±215	р і -і і і <0,05
CD3+CD4+		551±97	603±155	1223±311	р і -111 <0,05 р іі -і11 <0,05
CD3+CD8+		270±60	411±98	452±151	р і -111 <0,05 р і-іі <0,05
CD16+56+		105±52	280±150	309±151	р і -і і і <0,05 р і -іі <0,05
Содержание активационных маркеров на Т-лимфоцитах больных с ХПН, находящихся на гемодиализе, после 24 и 72 часов культивирования в присутствии ФГА (10мкг/мл)
Содержание активированных Т-лимфоцитов. CD3+CD25+через 24 часа культивирования (%)		32±8	44±11	55±6	р і -і і і <0,05 р іі-і11 <0,05 р і -іі <0,05
Содержание активированных Т-лимфоцитов через 72 часа культивирования CD3+71+ (пролиферация) (%)		34±11	77±13	86±11	р і -111 <0,05 р і -іі <0,05
Содержание активированных Т-лимфоцитов через 72 часа культивирования CD3+CD95+(апоптоз) (%)		43±7	25±6	21±8	рі -111 <0,05 рі -і\ <0,05
Выработка ИЛ-2 под действием ФГА через 24 часа культивирования лимфоцитов в среде с добавлением аутологичной сыворотки (АУС), выделенных из крови больных с ХПН, находящихся на гемодиализе
Концентрация Ил-2 (пг/мл) в культуральной среде, без АУС		104±32	195±53	249±97	р і -і і і <0,05 р і -іі <0,05
Концентрация Ил-2 (пг/мл) в культуральной среде с добавлением Аус		73±45	122±54	246±91	р і -111 <0,05 р іі-і11 <0,05 р і-іі <0,05
Показатели гуморального иммунитета у больных ХПН, находящихся на гемодиализе
Абсолютное содержание В-лимфоцитов, кл/мкл		131±52	210±55	322±120	р і-111 <0,05 р іі-і11 <0,05 р і -і і <0,05
Концентрация сывороточных иммуноглобулина IgG, г/л		7,0±0,5	11±8,3	11,0±3	р і -111 <0,05 р і -11 <0,05
Концентрация сывороточных иммуноглобулина IgA, г/л		0,7±0,4	2,2±0,4	2,5±1,5	р і -111 <0,05 р і -іі <0,05
Концентрация сывороточных иммуноглобулина igM, г/л		0,5±0,3	0,7±0,5	1,1±0,4	р і -111 <0,05

CD3+CD4+Т-хелперов, CD3+CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов. Количество естественных киллеров (CD16+56+ НК-клеток) было на нижней границе нормы. Во II группе обследуемых абсолютные показатели лимфоцитов были в пределах нормы, а отклонения в иммунограмме чаще касались снижения абсолютных показателей CD3+Т-лимфоцитов и CD3+\CD4+Т-хелперов, в тоже время абсолютное содержание CD8+Т-цито-токсических и CD16+56+НК обычно не снижалось (табл. 1).

Исследование функциональной активности Т-лимфоцитов в системе in vitro показало, что на лимфоцитах больных I группы после 24 час. инкубации с ФГА наблюдалось снижение экспрессии активационного маркера рецептора для ИЛ-2, что проявлялось в снижении количества CD3+СD25+ активированных Т-лимфоцитов, по сравнению с лимфоцитами здоровых доноров, а также с лимфоцитами больных ХПН II группы. Исследование активационных маркеров на Т-лимфоцитах - маркера клеточной пролиферации - CD71 и маркера апоптоза -CD95,через 72 часа после начала инкубации, показало снижение пролиферативной активности (уменьшалось количество CD71+), с нарастанием апоптоза Т-лимфоцитов (возрастало количество CD95+Т-лимфоцитов) в группе пациентов I группы. Во II группе больных также как и у здоровых доноров, таких изменений не наблюдалось: среди клеток больных ХПН 2-й группы через 72 часа культивирования выявлялось повышение CD71+Т-лим- фоцитов, количество CD95+Т-лимфо-цитов было ниже (табл 1).

Исследование выработки Т-лимфоцитами ИЛ-2 , в системе in vitro под действием ФГА, через 24 часа культивирования, показало, снижение его концентрации в культурах лимфоцитов от пациентов I группы. Во II группе обследуемых пациентов снижение ИЛ-2 выявлялось в меньшей степени. Угнетение выработки ИЛ-2 было более выражено у пациентов I группы, после культивирования клеток с 20% аутологичной сывороткой.

Полученные результаты могут являться подтверждением роли уремических токсинов, в частности п-крезола, в подавлении активации Т-лимфоцитов хелперов, так как при активации они продуцируют важнейший фактор роста Т-лимфоцитов- ИЛ-2, который необходим как для клеточной пролиферации, так и для их защиты от апоптоза (табл.1).

Таким образом, показано снижение количественных и функциональных показателей, характеризующих активность Т-клеточного иммунитета у больных I группы, с большим содержанием в сыворотках п-крезола. У пациентов II группы эти изменения были менее выраженными.

Состояние гуморального иммунитета оценивалось по абсолютному содержанию в крови В-лимфоцитов-CD19+, а также по количеству иммуноглобулинов в сыворотках больных I и II групп. У пациентов I группы были зарегистрированы более низкие показатели абсолютного содержания В-лимфоцитов (131±52кл/мкл), по сравнению со здоровыми донорами, а также с больными ХПН II группы. У последних эти показатели были выше и составляли 210±55кл/мкл.

При исследовании концентрации сывороточных иммуноглобулинов, у больных I группы выявлялось снижение концентрации иммуноглобулинов класса G (IgG-7,0±0,5г\л), по сравнению с возрастными нормами. У некоторых больных из этой группы, выявлялось снижение концентрации Ig А и IgМ. В сыворотках больных II группы показатели содержания иммуноглобулинов-IgG, Ig А и IgМ, не снижались, по сравнению с возрастными нормами (табл. 1). Как видно из таблицы, у больных I группы, с повышенной концентрацией п-крезола в сыворотке, наблюдается изменение функциональной активности гуморального иммунитета, проявляющееся снижением выработки IgG, IgA и IgM. Полученные результаты согласуются с данными J.T. de Carvalho и соавт., которые считают, что увеличение содержания п-крезола в крови сопровождает возникновение инфекционного процесса у больных с ХПН [53].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в ходе настоящего исследования данные позволяют предположить, что уремический токсин п-крезол, является неблагоприятным прогностическим фактором возникновения инфекционных осложнений у больных с терминальной ХПН.

Резюме:

экспериментальная и клиническая урология № 1 2 0 16