Показатели красной крови больных алкоголизмом с разными уровнями периферических маркеров окислительного стресса

Алкоголизм является широко распространенным заболеванием, борьба с которым требует междисциплинарного подхода, включающего изучение молекулярных механизмов токсических эффектов этанола [1]. Ранее был опубликован анализ литературных источников, посвященных изучению молекулярных механизмов формирования и развития окислительного стресса (ОС) у больных алкогольной зависимостью [2]. При изучении периферических маркеров ОС – карбо-нилированных белков (КБ) и ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) – в плазме крови больных алкоголизмом была обнаружена «персональная вариативность» этих показателей [3]. У большинства пациентов, поступающих на лечение в состоянии абстиненции, маркеры ОС превышали нормативные показатели, что свидетельствует о выраженном ОС. После стандартной антиалкогольной терапии наблюдалось снижение выраженности ОС, что согласуется с данными литературы [4, 5, 6]. Однако примерно у 20% пациентов в состоянии абстиненции измеряемые маркеры ОС статистически значимо не отличались от нормы.

В процессе лечения у таких пациентов зачастую происходило нарастание продуктов окисления белков и липидов плазмы крови [3]. Эти данные еще раз продемонстрировали, что роль ОС в патогенезе заболевания до конца не ясна. Для лучшего понимания роли ОС при патологических состояниях, изучения особенностей его формирования и развития у больных алкоголизмом необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведение сравнительного анализа параметров эритроцитов у больных алкоголизмом с разными уровнями периферических маркеров окислительного стресса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 57 больных алкоголизмом мужчин, поступивших в отделение аддиктивных состояний НИИ психического здоровья Томского НИМЦ с диагнозом по МКБ-10: Психические и поведенческие расстройства, вызванные употреблением алкоголя, абстинентное состояние (F10.302). Средний возраст пациентов составил 44,9±9,0 года.

Лабораторные исследования у пациентов проводили на 3-5-й день поступления в стационар после алкогольной детоксикации. Взятие крови осуществляли утром натощак с использованием стерильной системы однократного применения Vacutainer с антикоагулянтом EDTA (для гематологического анализа) и с ингибитором свертывания крови Sodium Hepаrin (для получения плазмы крови). Плазму разливали в пробирки для микропроб типа эппендорф, замораживали и хранили при температуре -80°С до использования.

Продукты окислительной модификации белков измеряли по уровню карбонилированных белков (КБ) в реакции с 2,4-динитрофенилгидразином [7]: использовали 2,4-динитрофенилгидразин фирмы Panreac (Espana). Концентрацию КБ выражали в нмоль/мг белка. Общий белок измеряли с помощью набора Total Protein 120 фирмы Cormay (Poland). Продукты перекисного окисления липидов оценивали по концентрации ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) с использованием набора реагентов TBA AGAT («Агат-Мед», Россия), концентрацию ТБК-РП выражали в нмоль/мл. Измерение оптической плотности конечных продуктов реакции проводили на спектрофотометре EPOCH (Bio Tek Instruments, USA).

Гематологический анализ крови осуществляли на гематологическом анализаторе Micros 60 (HORIBA Medical, Франция). Измеряли количество эритроцитов в литре крови (RBC, Red Blood Cell, 1012/л), гемоглобин (HGB, г/дл), гематокрит (HCT, %), средний объем эритроцита (MCV, Mean Corpuscular Volume, мкм3), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (MCHC, Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration, г/дл).

Контролем при проведении биологических исследований служили образцы плазмы крови, полученные от 34 практически здоровых мужчин, средний возраст которых соответствовал таковому в группе пациентов (42,8±10,9 года, р=0,487).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ STATISTICA для Windows, версия 12.0. Описательная статистика представлена медианой (Ме) и межквартильным интервалом (QL-QU). Средний возраст участников исследования представлен в виде среднего арифметического и стандартного отклонения (М±σ). Для межгруппового сравнения использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test). Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Результаты исследования маркеров окислительного стресса (карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов плазмы крови) представлены в таблице 1.

Таблица 1. Уровни карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов в плазме крови здоровых лиц (контроль) и больных алкоголизмом, Me (QL-QU)

Показатель	Контроль (n=34)	Больные алкоголизмом (n=57)	Уровень значимости
КБ, нмоль/мг белка	0,37 (0,29-0,45)	0,46 (0,38-0,52)	р<0,001
ТБК-РП, нмоль/мл	2,50 (2,10-2,90)	3,4 (2,8-4,2)	р<0,001

У больных алкоголизмом обнаружено статистически значимое (р<0,001) повышение уровня карбонилированных белков и ТБК-реактивных продуктов по сравнению с группой контроля.

Для проведения сравнительного анализа были сформированы две группы больных, которые различались по концентрации периферических маркеров ОС в плазме крови по сравнению с группой контроля. Значения медианы окисленных продуктов белков и липидов в группе контроля принимали за 100% (контрольное значение для КБ составило 0,37 нмоль/мг, для ТБК-РП ‒ 2,5 нмоль/мл). Если у пациента уровень КБ и/или ТБК-РП превышал контрольные значения более чем на 20%, мы предполагали у данного больного наличие состояния выраженного окислительного стресса, на этом основании он включался в группу ОС, которая оказалась преобладающей по численности (n=42). В случае, если подобное превышение не было зарегистрировано или оно составляло менее 20%, пациента относили к группе без ОС (n=15).

В таблице 2 приведены некоторые клинические 2, обе группы пациентов по анализируемым кли-характеристики этих групп. Как видно из таблицы ническим характеристикам были сопоставимы.

Т а б л и ц а 2. Клиническая характеристика групп больных алкогольной зависимостью

Показатель	Больные алкогольной зависимостью		Уровень значимости
	Отсутствие ОС (n=15)	Наличие ОС (n=42)
Возраст, лет (М±σ)	45,6±9,4	44,6±9,0	р=0,740
Длительность заболевания, лет Me (QL–QU)	11,0 (4,0-20,0)	14,5 (8,0-20,0)	р=0,191
Возраст систематического употребления алкоголя, лет Me (QL–QU)	23,0 (20,0-25,0)	22,5 (20,0-25,0)	р=0,790
Возраст первого обращения к наркологу, лет Me (QL–QU)	39,0 (35,0-48,0)	36,0 (32,0-43,0)	р=0,178

Т а б л и ц а 3. Маркеры окислительного стресса и характеристика красной крови у больных алкогольной зависимостью, Me (QL–QU)

Показатель	Больные алкогольной зависимостью		Уровень значимости
	Отсутствие ОС (n=15)	Наличие ОС (n=42)
КБ, нмоль/мг	0,38 (0,33-0,51)	0,46 (0,39-0,54)	р=0,046
ТБК-РП, нмоль/мл	2,87 (2,45-3,5)	3,6 (3,0-4,7)	р=0,010
Число эритроцитов (RBC), 1012/л	4,84 (4,51-5,04)	4,54 (4,06-4,80)	р=0,062
Гемоглобин (HGB), г/дл	15,0 (14,0-15,2)	14,6 (14,1-15,4)	р=0,762
Гематокрит (HCT), %	43,5 (41,2-44,5)	42,7 (40,3-43,8)	р=0,441
Средний объем эритроцитов (MCV), мкм3	91,0 (89,0-92,0)	93,0 (91,0-100,0)	р=0,045
Концентрация гемоглобина в эритроците (MCHC), г/дл	34,2 (33,6-35,3)	35,2 (33,7-35,6)	р=0,369

В таблице 3 представлены результаты измерения параметров ОС и эритроцитов.

Ранее нами было показано, что у пациентов с алкогольной зависимостью снижены все характеристики красной крови по отношению к контролю, за исключением среднего объема эритроцитов (MCV), повышенного при систематическом употреблении алкоголя по сравнению со здоровыми лицами [8]. Как следует из таблицы 3, пациенты с разной выраженностью ОС имели статистически значимые различия по параметрам, характеризующим окислительный стресс:  КБ

(р=0,046) и ТБК-РП (р=0,010), что обусловлено тем подходом, который был использован при формировании исследуемых групп. При сравнении гематологических показателей выявлены различия между группами по показателю средний объем эритроцитов (MCV): у пациентов из группы ОС MCV был статистически значимо (р=0,045) выше, чем у пациентов из группы без ОС, что свидетельствует о более часто встречающемся макроцитозе (объеме эритроцитов выше 100 мкм3) у пациентов с выраженным ОС. Действительно, у пациентов из группы без ОС не встречались эритроциты c MVC более 100 мкм3, в то время как у 11 пациентов (26,2%) из группы ОС обнаружено увеличение MVC до 100 мкм3 и более.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В норме средний объем эритроцитов (MVC) у мужчин составляет от 79 до 93 мкм3 [9]. В лите- ратуре приводятся данные о том, что у больных алкоголизмом зачастую выявляется макроцитоз [10, 11, 12, 13]. Согласно разным источникам, частота встречаемости макроцитоза у больных алкоголизмом варьируется от 14% до 90%, тогда как в общей популяции этот показатель находится в диапазоне 1,7-3,6% [14]. В собственном исследовании макроцитоз установлен у 26,2% обследованных пациентов с выраженным ОС.

Специально проведенные исследования на выборке больных алкогольной зависимостью с различными формами заболеваний печени, классифицированными с использованием гистологических методов, показали, что в группе пациентов без гепатопатии частота макроцитемии составляла около 50%, а в подгруппах пациентов c алкогольной гепатопатией макроцитоз чаще встречался при портальном фиброзе и остром алкогольном гепатите (от 64% до 80%) [10]. По мнению авторов цитируемой работы, макроцитоз и повышение значений гаммаглутамилтранспептидазы и глута-мино-щавелево-уксусной трансаминазы выступают в качестве показателей стойкости употребления алкоголя. К тому же наличие макроцитоза может являться признаком развития у пациента некоторых видов анемий, в том числе и тех, которые вызваны дефицитом в организме витамина В12 или фолиевой кислоты либо увеличением скорости образования эритроцитов. Вместе с тем отмечается, что при алкогольной зависимости макроцитоз не всегда связан с анемией [11].

Хорошо известно, что ведущими факторами, определяющими токсический повреждающий эффект алкоголя, являются его мембранотоксическое действие, истощение имеющихся в организме запасов окисленного НАД, образование ацетальдегида [12]. Мембранотропные эффекты этанола часто исследуются на мембранах эритроцитов, в частности показано уменьшение плотности упаковки фосфолипидов, возрастание текучести липидного бислоя мембран эритроцитов [2, 12, 15], изменение мембранного каркаса клеток у больных, страдающих алкоголизмом [16]. При этом, помимо того, что этанол и ацетальдегид непосредственно влияют на физическое состояние мембран, в организме существуют механизмы, через которые этанол повреждает мембраны эритроцитов опосредованно. Так, в результате поражения печени и извращения синтеза липидов происходит повышенное отложение холестерола и фосфолипидов в мембранах эритроцитов. Нарушение липидного состава мембран сопровождается увеличением площади клеточной поверхности и изменением формы эритроцитов. В зависимости от качественного и количественного состава липидов мембраны эритроцитов приобретают вид «мишеневидных», «отросча-тых» (эхиноциты), с ротообразной полоской просветления (стоматоциты), макроциты имеют круглую форму [12]. Определенную роль в реализации мембранотоксических эффектов алкоголизации играет повышенная генерация активных форм кислорода при хроническом поступлении в организм высоких доз этанола [2, 4, 17]. Полученные в настоящем исследовании данные продемонстрировали, что высокий уровень макроци-тоза обнаруживается у 26,2% больных алкоголизмом группы ОС, средний объем эритроцитов в этой группе пациентов статистически значимо (р=0,045) выше, чем в группе без ОС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, представленные результаты доказательно подтверждают связь увеличения объема эритроцитов и макроцитоза при алкоголизме с выраженностью окислительного стресса. Полученные итоговые показатели могут быть применены в практической наркологии при решении вопроса о назначении адъювантной (вспомогательной) антиоксидантной терапии на основании данных общеклинического анализа крови без привлечения дополнительного, более трудоемкого и дорогостоящего определения оксидативного статуса.