Показатели периферической крови как предикторы эффективности влияния гидрофильной фракции пчелиной обножки на организм крыс при иммобилизационном стрессе

Стресс – защитная реакция организма от любых неблагоприятных воздействий [13]. Это общий адаптационный синдром, который сопровождает эволюцию живых систем, активируя новые навыки по выживанию и адаптации. На стрессорное воздействие отвечает весь организм, в том числе и его система крови, как важнейшая система обеспечения гомеостаза [1]. На этом основании показатели периферической крови выступают предикторами эффективности восстановления гомеостических постстрессорных нарушений [11]. Если исследованию острого действия стресс факторов на организм посвящено много исследований, то значительно меньше изучены эффекты хронических, многократно повторяющихся воздействий [6]. Вместе с тем, именно хронический стресс часто сопровождает жизнь человека и животных, и может являться триггерным механизмом многих нозологий. Это сопровождается, главным образом, реакционным действием избыточной продукции свободных радикалов (активных форм кислорода), которые обусловливают деструкцию липидов, белков, а в результате, и мембран клеток. Многими исследованиями установлено, что потребление низкомолекулярных антиоксидантов вместе с пищей восстанавливает баланс про – и антиоксидантной системы и повышает степень адаптации организма к стрессу– воздействию. В этой связи изучение про- дуктов пчеловодства (известных своими антиоксидантными свойствами), в частности, инновационного продукта - гидрофильной фракции пчелиной обножки, представляется крайне актуальным [3].

В связи с вышесказанным цель нашей работы заключалась в изучении показателей периферической крови крыс при иммобилизационном стрессе и применении гидрофильной фракции пчелиной обножки в качестве источника эффективных природных водорастворимых антиоксидантов, предотвращающих трансформацию защитных механизмов стресса в патологические последствия.

Материал и методы исследований. Исследования были проведены на половозрелых самцах крыс стока Wistar в летне-осенний период. Животные содержались в условиях конвенционального вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. Крысы содержались группами по 8 голов в клетке на кукурузном подстиле для лабораторных животных. Питание животных осуществлялось полнорационным кормом «Чара» для содержания грызунов (производитель ООО «Ассортимент Агро»). Крысы имели свободный доступ к воде и корму. Световой день продолжительностью 12 ч. Температура в комнате содержания 22-24 оС. Кратность объема воздуха в комнате содержания животных не менее 7 объемов в час. При поступлении крыс в виварий, перед началом экспе- риментальных работ находились на адаптационном периоде - 3 дня. Работа с животными выполнена в соответствии с правилами лабораторной практики (приказ МЗ РФ №199н от 1 апреля 2016 г.).

В качестве модели воздействия стресс–фактора использовали иммобили-зационный стресс. Иммобилизационный стресс моделировали при комнатной температуре, ежедневно помещая животное в рестрейнер размером 15,0х5,0х4,0 см, ограничивающий их движение в течение 3-х часов на протяжении 21 дня. Крысам опытных групп внутрижелудочно вводили 10 % водный раствор гидрофильной фракции пчелиной обножки в суммарной дозе 3,9 мл/сут. с помощью желудочного зонда. Крысам интактной группы вводили дистиллированную воду эквивалентно количеству гидрофильной фракции пчелиной обножки.

Дизайн опыта заключался в следующем. Животных подразделили на группы (n=8) : 1 - интактная группа; 2 - группа «Стресс», состоящаая из крыс, подвергавшихся иммобилизационному стрессу в течение 21 дня; опытная группа № 1 - крысы, сначала получавшие гидрофильную фракцию пчелиной обножки в течение 21 дня, а затем в течение следующих 21 дня подвергавшиеся иммобилизационному стрессу с продолжением введения гидрофильной фракций пчелиной обножки (сначала профилактика, затем коррекция); опытная группа № 2 - крысы, сначала получавшие гидрофильную фракцию пчелиной обножки в течение 21 дня, затем после прекращения приема препарата подвергавшиеся иммобилизационному стрессу в течение 21 дня (только профилактика); опытная группа № 3 - крысы, сначала подвергавшиеся иммобилизационному стрессу 21 день, а затем, после отмены, получавшие гидрофильную фракцию пчелиной обножки (только коррекция); опытная группа № 4 - крысы, получавшие гидрофильную фракцию пчелиной обножки в течение 21 дня, и на этом фоне в течение всего времени эксперимента подвергавшиеся иммобилизационному стрессу (одновременно профилактика и коррекция). Опытные группы сравнивали с интактны- ми животными и крысами группы «Стресс».

Гидрофильная фракция пчелиной обножки - биологически активная фракция пыльцы, отличающаяся от сырья (нативной пчелиной обножки) микробиологической чистотой, большими сроками хранения без изменений биохимических показателей, с высоким выходом биологически активных веществ (патент № 2538635 «Способ переработки пчелиной обножки»). Полученный инновационный продукт представляет собой жидкость приятного кисловатого вкуса, с содержанием сухих веществ в количестве 10-12 %, с высоким содержанием витаминов группы В, витамина С, макро- и микроэлементов -калий, натрий, магний, железо, цинк, хром и др., свободных аминокислот (L-цистеин, L-глутаминовая кислота, фенилаланин), пептидов, флавоноидов (рутин, катехин, кверцетин), фруктозы и глюкозы [2].

Для изучения показателей кровь забирали из нижней полой вены при помощи стерильного шприца объемом 10 мл. Кровь отстаивали и центрифугировали в течение 10 минут при оборотах 3000. Цельную кровь исследовали на гематологическом анализаторе Sesmex XN-1000 по комплексу показателей. Дифференциальный подсчет лейкоцитов (лейкограмма) в мазках крови, окрашенных по методу Романовского-Гимза, на стекле фиксировали по методу Май-Грюнвальда. Крыс выводили из эксперимента в зависимости от опытной группы на 22 или 42 день под ветеринарным наркозом (ксила 6 мг/кг и золетил 1015 мг/кг) методом обескровливания. Статистическую обработку результатов, полученных в опытах на животных, проводили с использованием системы Statistica UA for Windows 13 Ru. Для статистического анализа показателей парных рядов связанных выборок применяли критерий Шапиро-Уилко. Результаты представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего результата M±m, где M - выборочное среднее, m -ошибка среднего, n - выборка. Различия между группами определяли по критерию Ньюмана-Кейсла однофакторным дисперсионным анализом, достоверными резуль- таты считали при уровне значимости р <0,05 [4].

Результаты исследований. Г. Се-лье определил «стресс» (от англ. stress – напряжение) как неспецифическую реакцию организма, развивающуюся под воздействием различных причинных факторов - стрессоров, создающих повышенные требования к организму [13]. Установлено, что при их воздействии происходит активация          гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой системы и в организме увеличивается содержание гормонов-кортикостероидов и катехоламинов.

Наши данные указывают на то, что иммобилизационный стресс вызвал активацию симпатической нервной системы, гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой и ренин - ангиотензив-ной системы, а это ведет к экспрессии катехоламинов, кортикостероидов, глюкагона и гормона роста. В свою очередь изменение гормонального фона привело и к изменениям показателей периферической крови. По результатам проведенных исследований установлено, что у крыс, подвергшихся иммобилизационному стрессу, в сравнении с интактными животными, был выявлен эритроцитоз - 8,28±0,41* (р < 0,05).

Таблица 1 - Клеточный состав периферической крови крыс под влиянием гидрофильной фракции пчелиной обножки в условиях иммобилизационного стресса ____________________

Активизация коры надпочечников, как центра стрессовых реакций сопровождается усилением секреции глюкокортикоидов, которые и стимулируют эритропоэз, что в свою очередь сопровождается эритроцитозом [14]. Минимальный уровень эритроцитоза среди крыс, подвергавшихся стрессу, отмечен в опытной группе 1, при этом он составил 7,89±0,30 х1012/л, максимальный - в опытной группе 2 -9,12±0,51* х 1012/л. По отношению к группе «Стресс» изучение эритроцитов крови у животных опытных групп 3 (только коррекция) и 4 (одновременно профилактика и коррекция) достоверных изменений не выявило.

По нашим данным, при стрессе происходило достоверное снижение тромбоцитов с 806,17±129,43 у интактных животных до 563,75х109/л у крыс, испытывающих хронический стресс без поддержки. Тромбоцитопения при стрессе объяс- няется разрушением мембран тромбоцитов свободными радикалами, образующимися в избытке в ответ на стрессовое воздействие. Это приводит к гиперкоагуляции, снижению протромбинового времени, эффектам вазоконстрикции, сужению просвета сосудов, повышению артериального давления [7]. Все эти процессы носят, прежде всего, адаптивный характер, в тоже время невозможность возвращения к нормальным показателям при отсутствии компенсаторных реакций приводят к патогенезу сердечно–сосудистых заболеваний. В опытных группах, получавших гидрофильную фракцию пчелиной обножки, выраженная тромбоцитопения наблюдается и у крыс опытной группы 3 - 427,00±87,75*. В тоже время, у крыс, испытывающих стрессовое воздействие, но при введении гидрофильной фракции пчелиной обножки показатели приближались к уровню интактных животных. Так, в опытной группе

1 уровень тромбоцитов составил 773,00±67,65** и опытной группе 4 -725,40±181,97**, что указывает на положительное влияние изучаемого инновационного средства. Полученные результаты подтверждают, что функциональная активность системы красной крови и тромбоцитарного звена во многом определяет адаптивные возможности организма [15].

Лейкоциты - клетки белой крови, выполняющие роль иммунокомпетентных клеток, клеточного и гуморального звеньев иммунитета (лимфоциты), естественной резистентности (гранулоциты, моноциты). Живут и функционируют эти клетки недолго - всего 3-10 дней, поэтому они более подвержены различным внешним и внутренним воздействиям. В группе «Стресс» мы наблюдали выраженный лейкоцитоз -до 11,64х109/л, что указывает на значительную напряженность иммунной системы при стресс воздействии. В опытных группах 1,2,4 - отмечено снижение показателя до уровня инактных животных 8,25±1,28 х109/л и даже ниже, но в пределах физиологической нормы.

Стресс стимулирует воспалительный ответ, активацию макрофагов, генерацию активных форм кислорода [9, 10]. Безусловно, это объясняет лейкоцитоз с одной стороны, а с другой - положительное действие гидрофильной фракции пчелиной обножки в качестве антиоксиданта.

Лимфоциты - гетерогенная популяция клеток, которая является центральным звеном в реакциях специфического иммунитета и отражает его состояние в различных условиях.

В нашем опыте, при стрессе у крыс происходило достоверное снижение уровня лимфоцитов до 64,00±2,14 %. Лимфопения - известный маркер стресса, связан с массовым разрушением лимфоцитов периферической крови под действием гормонов [12]. В группах животных, испытывающих стресс, но с поддержкой исследуемого средства, уровень лимфоцитов был выше и соответствовал группе интактных животных - 73,77±4,8 %.

Гранулоциты включают нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. Эти клетки -главные участники в борьбе с инфекциями, воспалительными и аллергическими реакциями. Установлено, что для стресса характерны эозинопения, нейтрофильный лейкоцитоз, сопровождающийся инволюцией тимико-лимфатического аппарата [5].

Активация гипофизарноадреналовой и симпатоадреналовой систем приводит к развитию феномена гиперплазии кроветворной ткани костного мозга и увеличению клеточности переферической крови [6]. Это мы наблюдали не только по отношению к эритроцитам, но и к гранулоцитам. Так, в группе «Стресс» уровень гранулоцитов был достоверно выше -27,14±1,77 %, чем у интактных животных - 18,60±0,54. Выявленную динамику мы связываем с тем, что глюкокортикоиды стимулируют гранулоцитопоэз, мобилизуют клетки из костномозгового гранулоцитарного резерва, а кроме того препятствуют выходу гранулоцитов из крови в ткани [7]. Во всех опытных группах также произошло повышение уровня гранулоцитов до 20,05±4,3 % - 22,74±2,45 %. Однако, это достоверно ниже, чем в группе стресс.

В группах животных, которые получали гидрофильную фракцию пчелиной обножки, мы наблюдали ее положительное влияние. На это указывают предикторы -клетки периферической крови. Изучаемое нами средство позитивно влияет на организм, повышая устойчивость организма за счет включения его адаптивных механизмов. Мы связываем это с уникальным составом гидрофильной фракции пчелиной обножки, обладающей антиоксадантными свойствами. Среди водорастворимых антиоксидантов важное значение имеет глутатион, играющий ключевую роль в защите клеток от токсических интермедиатов кислорода и снижающий негативное влияние окислительного стресса. Глутатион не является незаменимым веществом и может быть синтезирован из аминокислот L-цистеина, L-глутаминовой кислоты и глицина. Отметим, что водная фракция пчелиной обножки содержит эти аминокислоты в значимом количестве. Аскорбиновая кислота, особенно важная для антиоксидантной защиты структур мозга. В водной фракции пчелиной обножки витамин С присутствует в наибольшем количестве в сравнении с другими витаминами, 20 % от суточной нормы. Наиболее адекватным синергистом и практически повсеместным спутником аскорбиновой кислоты является система физиологически активных фенольных соединений (в растениях биофлавоноиды). Фенолы выступают в роли ловушек реактивного кислорода, превращаясь сами в малоактивные феноксильные радикалы. Флавоноиды присутствуют в большом количестве 240 мг/100 г в расчете на рутин, представлены катехинами, кверцетином и рутином. В пчелиной обножке содержится аминокислота фенилаланин в количестве 8,2 % от суммы свободных аминокислот, которая является исходным соединением для биосинтеза флавоноидов в растениях. В гидрофильной фракции присутствуют витамины: В5 и его производные, В2, В1. Почти все из перечисленных витаминов входят в состав групп важнейших ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные и другие обменные процессы. Витамины группы В выполняют функции коэнзимов. По минеральному составу пчелиная обножка превосходит многие пищевые продукты и отличается сбалансированным их количеством. Из 24 элементов, обнаруженных в крови человека, 22 присутствуют в пчелиной обножке. В гидрофильной фракции пчелиной обножки много калия, натрия, фосфора, присутствует магний, цинк, медь, селен и целый ряд других минеральных веществ. Эти микроэлементы также участвуют в функционировании антоксидантной системы организма. Например, цинк, входит в активный центр фермента суперок-сиддисмутазы.

Заключение. Уникальный комплекс антиоксидантов, содержащийся в гидрофильной фракции пчелиной обножки, положительно влияет на динамику клеточного состава крови в зависимости от функционального состояния за счет оптимизации активности антиоксидантной системы в организме и, как следствие, повышает устойчивость организма к воздействию стресса.

Резюме

Новизна исследования заключается в изучении влияния на организм инновационного продукта – гидрофильной фракции пчелиной обножки по классическим предикторам – показателям периферической крови. Установлено, что благодаря многокомпонентному составу данный продукт оптимизирует клеточный состав крови крыс опытных групп при стрессе, приводя его к уровню интактных животных. Так, при развитии стресса, вызванного иммобилизацией, у крыс отмечали сдвиги гемопоэза: эритроцитоз, лейкоцитоз с одновременной лимфопенией, повышение содержания тромбоцитов крови. В опытных группах на фоне применения гидрофильной фракции пчелиной обножки этих негативных изменений не происходило, как в опытных группах при пролонгированном применении продукта (ОГ 1, ОГ 4), или они были не столь масштабны и не затрагивали все изучаемые показатели крови (ОГ 2, ОГ 3). Главным образом, это обусловлено выраженным антиоксидантным действием, сдерживанием образования активных форм кислорода, возникающих при развитии стресса и формированием основы для восстановления гомеостатических механизмов в организме. Практический интерес связан с известными общебиологическими механизмами стресса и, как следствие, возможности проецирования результатов исследования как на животных, так и на человека.