Показатели свободнорадикального окисления в крови больных немелкоклеточным раком легкого, перенесших COVID-19 различной степени тяжести

Введение. Новая коронавирусная инфекция (COVID-19), распространяющаяся по миру с конца 2019 г., по данным ВОЗ была подтверждена в 409 млн случаев и стала причиной около 6 млн смертей [1]. Особый инте- рес представляет сочетание коронавирусной инфекции и онкопатологии, особенно рака легкого (РЛ), являющегося одним из наиболее частых видов рака среди больных COVID-19. Большинство новых случаев РЛ диагностиру- ется у пациентов старше 65 лет, и в последние годы наблюдается тенденция к увеличению данного показателя [2]. Легкие являются органами, вовлеченными в начальный очаг инфекции, отмечается высокий риск пневмонии, а в тяжелых случаях – развития острого респираторного дистресс-синдрома, часто с необратимым рубцеванием легочной ткани и респираторными проблемами, сохраняющимися в значительной степени после выздоровления [3, 4]. Разрушение клеток легких, вызванное инфекцией COVID-19, запускает локальные иммунные ответы Т- и В-лимфоцитов, от выраженности и направленности которых в значительной мере зависит тяжесть коронавирусной инфекции [3]. При заражении COVID-19 уровень смертности больных раком легкого выше, чем у населения в целом [5, 6]. При этом оказалось, что пол человека играет важную роль в исходах COVID-19 [7]. В метаана-литическом исследовании, проведенном в 2022 г., показано, что мужской пол, средний возраст и недавняя активная терапия рака были факторами, связанными с высокой смертностью [8]. Также отмечено, что в дополнение к возрасту и хроническим сопутствующим заболеваниям потребность в инвазивной или неинвазивной искусственной вентиляции легких и женский пол являются факторами риска респираторных долгосрочных осложнений COVID-19 [9].

Общеизвестна роль нарушения баланса окислительно-восстановительных процессов в инициации злокачественной трансформации и прогрессировании неоплазии [10–12]. Развитие онкопатологии сопровождается в большинстве случаев интенсификацией свободнорадикального окисления и истощением или перераспределением антиоксидантных резервов организма [13, 14]. Так, работами, проведенными в НМИЦ онкологии, показаны активация свободнорадикальных процессов и нарушение соотношения антиоксидантных ферментов в крови больных раком яичников, зависящие от стадии процесса и клинической картины течения заболевания [15]. Также установлено, что появление метастазов у больных раком шейки матки сопровождается усилением перекисного окисления липидов

Высказывается предположение, что COVID-19 можно рассматривать как метаболическое заболевание, в развитии которого существенную роль играют ROS (активные формы кислорода), а также глутатионзависи-мая антиоксидантная система [21, 22]. Данные литературы свидетельствуют о роли редокс-дисбаланса в патофизиологии COVID-19 [23], показано, что тяжесть заболевания коррелирует с повышением уровня свободнорадикальных продуктов [24]. При этом N. Majum-der et al. приходят к заключению о необходимости детальной идентификации продуктов свободнорадикального окисления, способствующих нарушению редокс-статуса в крови коронавирусных больных [23]. Представлены доказательства того, что возрастное снижение окислительно-восстановительного гомеостаза и метаболических процессов, контролируемых клеточными тиолами и особенно восстановленным глутатионом, является фактором риска тяжелых осложнений инфекции SARS-CoV-2, которую саму по себе рассматривают как прооксидантное и тиолистощающее событие [25].

Цель исследования. Оценка интенсивности перекисного окисления липидов и показателей антиоксидантной системы в клетках крови больных раком легкого, перенесших COVID-19 различной степени тяжести.

Материалы и методы. В исследование было включено 60 больных, проходивших лечение в торакальном отделении ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России с 2020

по 2021 г. по поводу морфологически верифицированного немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) I–IIIA стадий (T 1-3 N Х M 0 ) с рабочим статусом ECOG (PS) ≤ 2, адекватной функцией органов (согласно стандартным лабораторным тестам, включающим общий анализ крови, биохимию сыворотки и коагулограмму). Стадию определяли по классификации TNM. Поэтапное обследование больных до начала лечения включало компьютерную томографию грудной клетки, брюшной полости и головного мозга. Сканирование костей было выполнено на основании симптомов. Больные были разделены на две группы: контрольную, которую составили 30 больных РЛ с бессимптомными или легкими случаями COVID-19 (15 мужчин и 15 женщин), и основную, включавшую 30 больных РЛ (15 мужчин и 15 женщин), перенесших COVID-19 в тяжелой или среднетяжелой форме. В контрольную группу вошли больные в возрасте от 51 до 75 лет, в основную – от 51 до 71 года. Средний возраст больных составил 59,11±2,89 года, значимых отличий между контрольной и основной группами не отмечено. Перед началом исследования от участников было получено письменное информированное согласие.

Согласно рекомендациям ПЦР-анализ мазка из носоглотки на COVID-19 был проведен всем пациентам.

Критериями включения являлись возраст старше 18 лет, отсутствие наркотической или алкогольной зависимости; критериями исключения –известные предшествующие воспалительные состояния.

Для оценки окислительного статуса клеток крови больных РЛ в лимфоцитах и нейтрофилах исследовали ряд показателей, характеризующих интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) и функционирование антиоксидантной системы (АС), с использованием общепринятых спектрофотометрических методов [26].

Выделение лимфоцитов и нейтрофилов осуществляли общепринятым методом в двойном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см3 и ρ=1,119 г/см3. Вначале в пробирку вносили раствор фиколл-урографина, имеющий плотность 1,119 г/см3, затем на него аккуратно наслаивали раствор фиколла с плотностью 1,077 г/см3. Плазму крови наслаивали на двойной градиент, центрифугировали 25 мин при 1,5 тыс. об./мин (400 g). После центрифугирования получали кольцо лимфоцитов (верхнее) и нейтрофилов (нижнее), а в осадке находились эритроциты. Полученные кольца отбирали в чистые центрифужные пробирки и дважды отмывали физиологическим раствором (0,9 %), центрифугируя по 20 мин при 1,5 тыс. об./мин (400 g). Надосадок сливали, осадок ресуспендировали в 1 мл физраствора. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.

Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию в клетках крови (лимфоцитах и нейтрофилах) первичных продуктов диеновых конъюгатов (ДК) и наиболее стабильного вторичного продукта ПОЛ малонового диальдегида (МДА). Концентрацию МДА определяли методом с тиобарбитуровой кислотой при длине волны 540 нм, содержание ДК – по оптической плотности гептанового экстракта при длине волны 232 нм [26]. Оценивали активность важнейших антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионпероксидазы (ГПО), а также уровень восстановленного глутатиона. Активность СОД определяли методом H.P. Misra, I. Fridovich по степени ингибирования восстановления нит-росинего тетразолия в присутствии супероксидного радикала, генерируемого в реакции восстановления молекулярного кислорода адреналином в щелочной среде [26]. Активность ГПО определяли при длине волны 412 нм в реакции расщепления гидроперекиси третичного бутила, используя в качестве субстрата восстановленный глутатион. Содержание восстановленного глутатиона определяли по реакции с 5,5-дитиобис(2-нитробензойной кислотой) при длине волны 412 нм [26]. Измерения проводили на спектрофотометре Apel PD-303UV (ApelCo., Ltd., Япония).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Statis-tica 10.0. Соответствие распределения нормальному оценивали с помощью критерия Шапиро – Уилка. Для статистического ана- лиза применяли непараметрический критерий Манна – Уитни. Поскольку сравнение групп производили попарно (для каждого показателя между контрольной и основной группой и независимо от этого между показателями у мужчин и женщин в каждой из групп), поправку Бонферрони для множественности сравнений не использовали, во всех случаях статистически значимыми считали отличия при р<0,05. При 0,05<р<0,1 предполагали наличие тенденции к значимости (при сравнении двух независимых выборок). Полученные данные в таблицах представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения среднего (M±σ), медианы и значений нижнего и верхнего квартилей (Me [Q25; Q75]).

Результаты. Содержание продуктов ПОЛ и показатели АС в лимфоцитах крови больных РЛ, перенесших COVID-19 в легкой или тяжелой форме, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Table 1

Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в лимфоцитах крови больных раком легкого в зависимости от тяжести перенесенного COVID-19

Indicators of lipid peroxidation and antioxidant system in blood lymphocytes of patients with lung cancer depending on COVID-19 severity

Группа Group	Пол Sex	МДА, нмоль/млн клеток MDA, nmol/million cells	ДК, мкмоль/млн клеток DC, μmol/million cells	СОД, ед. активности/мг белка SOD, U/mg protein	Глутатион, мкмоль/млн клеток Glutathione, µmol/million cells	ГПО, МЕ/мг белка GP, ME/mg protein
и Й 2 & ° И О о «	Мужчины Men n=15	1,214±0,324 1,23 [0,9; 1,48]	1,341±0,756 1,262 [0,57; 1,745]	6,09±3,563 5,31 [3,35; 8,71]	79,6±32,5 81,5 [47,4; 111,1]	343,1±205,8 247,4 [219,2; 393,8]
	Женщины Women n=15	1,698±0,698 1,67 [1,1; 2,24] р 2 =0,040057	5,091±1,961 4,137 [3,66; 7,705] р 2 =0,000004	8,077±4,76 8,147 [3,46; 11,23] р 2 =0,265280	188,8±52,7 201,5 [142,1; 225,2] р 2 =0,000026	234,0±94,3 213,8 [158,7; 265,4] р 2 =0,051802
К ® * я о « и S о о	Мужчины Men n=15	2,14±0,543 2,17 [1,68; 2,65] р 1 =0,000057	2,242±0,985 2,153 [1,57; 3,111] р 1 =0,017080	3,328±1,425 3,839 [1,869; 4,48] р 1 =0,029905	129,4±21,7 129,0 [114,9; 146,6] р 1 =0,000205	455,6±207,8 413,7 [330,5; 464,8] р 1 =0,024648
	Женщины Women n=15	3,068±0,979 2,87 [2,3; 3,96] р 1 =0,000333 р 2 =0,004494	4,127±1,622 4,06 [2,55; 5,82] р 1 =0,177647 р 2 =0,003020	7,763±5,298 5,792 [4,038; 9,78] р 1 =0,819546 р 2 =0,005811	137,8±59,2 146,7 [79,2; 181,4] р 1 =0,019104 р 2 =0,520283	508,6±242,0 515,8 [305,2; 721,2] р 1 =0,000841 р 2 =0,604127

Примечание. Статистическая значимость различий: р 1 – между контрольной и основной группами; р 2 – между показателями мужчин и женщин в соответствующей группе. Далее обозначения те же.

Note. p 1 – the differences are significant compared with the control; р 2 – the differences are significant if men and women of the same group are compared. Further designations are the same.

У женщин как контрольной, так и основной групп содержание в лимфоцитах обоих продуктов ПОЛ было выше, чем у мужчин. В группе с легким течением COVID-19 превышение медианы МДА у женщин составило 1,4 раза (35,8 %, р=0,04), ДК – 3,3 раза (227,8 %, р=0,0000), в группе с тяжелым COVID-19 значения медиан были выше, чем у мужчин, в 1,3 раза (на 32,3 %) и в 1,9 раза (на 88,6 %) соответственно (р≤0,0045).

При анализе активности СОД оказалось, что в контрольной группе значимые различия между мужчинами и женщинами отсутствовали, а у больных с тяжелым течением COVID-19 медиана активности СОД в лимфоцитах женщин была выше в 1,5 раза (р=0,0058). Содержание восстановленного глутатиона у женщин контрольной группы было в 2,5 раза выше, чем у мужчин (р=0,0000), что сопровождалось тенденцией к снижению ГПО на 31,8 % (р=0,0518). При этом после тяжелой формы COVID-19 не выявлено различий между мужчинами и женщинами по показателям глутатионовой системы.

Особенно важным представлялось сопоставление интенсивности СРП у больных РЛ с легким и тяжелым течением COVID-19. Уро- вень МДА был значимо выше как у мужчин, так и у женщин основной группы – в 1,8 раза (р≤0,0003). Уровень ДК при тяжелом течении COVID-19 также был выше, но только у мужчин – в 1,7 раза (р=0,0171), что сопровождалось почти двукратным снижением активности основного фермента первой линии антиоксидантной защиты СОД (р=0,0299) и повышением функциональной активности глутатионовой системы, относящейся ко второй линии антиоксидантной защиты: уровень восстановленного глутатиона был выше в 1,6 раза (р=0,0002), активность ГПО – в 1,3 раза (р=0,0246) по сравнению с показателями лимфоцитов больных РЛ контрольной группы. У женщин с тяжелой формой COVID-19 наряду с отсутствием прироста ДК и изменения активности СОД наблюдались разнонаправленные отличия в глутатионовой системе – более низкое содержание восстановленного глутатиона (в 1,4 раза, р=0,0191) и активация ГПО (в 2,2 раза, р=0,0008) по сравнению с больными РЛ, легко перенесшими COVID-19.

Данные, полученные при исследовании параметров СРП в нейтрофилах крови больных РЛ, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Table 2

Показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в нейтрофилах крови больных раком легкого в зависимости от тяжести перенесенного COVID-19

Indicators of lipid peroxidation and antioxidant system in blood neutrophils of patients with lung cancer depending on COVID-19 severity

Группа Group	Пол Sex	МДА, нмоль/млн клеток MDA, nmol/million cells	ДК, мкмоль/млн клеток DC, μmol/million cells	СОД, ед. ак-тивности/мг белка SOD, U/mg protein	Глутатион, мкмоль/млн клеток Glutathione, µmol/million cells	ГПО, МЕ/мг белка GP, ME/mg protein
	Мужчины Men n=15	1,351±0,487 1,36 [1,1; 1,52]	2,747±1,43 3,077 [1,229; 4,06]	9,452±4,819 9,452 [6,069; 13,58]	70,07±33,8 73,33 [44,5; 92,99]	283,7±210,0 274,9 [111,8; 403,3]
	Женщины Women n=15	1,775±0,598 1,60 [1,32; 2,26] р 2 =0,027054	3,70±1,759 3,323 [2,05; 5,475] р 2 =0,205843	4,282±1,162 4,037 [3,27; 4,935] р 2 =0,005811	114,8±45,7 124,5 [70,6; 154,7] р 2 =0,007762	234,5±129,9 280,4 [115; 312,9] р 2 =0,924786

Группа Group	Пол Sex	МДА, нмоль/млн клеток MDA, nmol/million cells	ДК, мкмоль/млн клеток DC, μmol/million cells	СОД, ед. ак-тивности/мг белка SOD, U/mg protein	Глутатион, мкмоль/млн клеток Glutathione, µmol/million cells	ГПО, МЕ/мг белка GP, ME/mg protein
О	Мужчины Men n=15	2,153±0,703 2,285 [1,49; 2,61] р 1 =0,001919	3,711±1,575 3,711 [2,45; 4,727] р 1 =0,110288	6,271±3,054 6,112 [4,564; 7,98] р 1 =0,053765	128,2±55,2 128,2 [74,8; 171,9] р 1 =0,004105	268,4±к195,5 229,0 [140,7; 270,2] р 1 =0,835467
	Женщины Women n=15	2,876±0,903 3,09 [2,1; 3,55] р 1 =0,001508 р 2 =0,022741	7,053±2,509 7,053 [5,02; 9,318] р 1 =0,000724 р 2 =0,000533	7,991±3,204 7,134 [5,536; 10,86] р 1 =0,000333 р 2 =0,130040	123,9±25,9 118,8 [105,6; 146,5] р 1 =0,950390 р 2 =0,787462	415,3±229,4 267,5 [232,5; 649,1] р 1 =0,101343 р 2 =0,059127

Как и в лимфоцитах, содержание продуктов ПОЛ в нейтрофилах у большинства женщин было выше, чем у мужчин. По содержанию МДА различия между основной и контрольной группами достигали 1,3 раза (р<0,03), содержание ДК было статистически значимо выше только у женщин основной группы – в 1,9 раза (р=0,0007). Активность СОД в контрольной группе была выше у мужчин – в 2,2 раза (р=0,0058), а в основной группе значимых половых отличий не выявлено. Содержание восстановленного глутатиона в нейтрофилах в контрольной группе было выше у женщин, чем у мужчин (различие в медианах составило 1,7 раза, р=0,0078), в основной группе различия отсутствовали, что полностью повторяло картину в лимфоцитах. Активность ГПО проявляла тенденцию к более высокому уровню у женщин только в основной группе (р=0,0591).

Содержание МДА в нейтрофилах было существенно выше у больных РЛ с тяжелым течением COVID-19: различия в медианах достигали 1,7 раза у мужчин и 1,9 раза у женщин (р<0,002). Содержание ДК в основной группе было выше по сравнению с контрольной только у женщин (в 2,1 раза, р=0,0007). Активность СОД в основной группе была выше у женщин в 1,8 раза (р=0,0003), а у мужчин, напротив, проявляла тенденцию к снижению (р=0,0538) по сравнению с контрольной группой. Содержание восстановленного глутати- она зависело от тяжести COVID-19 только у мужчин, у которых в основной группе оно было выше в 1,7 раза (р=0,0041), а медианы активности ГПО не отличались ни у мужчин, ни у женщин.

Обсуждение. Сопоставление данных по интенсивности ПОЛ в лимфоцитах и нейтрофилах крови больных РЛ показало, что как у мужчин, так и у женщин содержание МДА в обоих видах клеток было статистически значимо выше в случае перенесения COVID-19 в тяжелой форме. Следует отметить, что МДА является единственным продуктом перекисного окисления липидов, соответствующим уровню доказательности А для оценки выраженности оксидативного стресса [27]. Относящийся к наиболее мутагенным соединениям, МДА способен вызывать полимеризацию белков, разрушение ДНК, сульфгидрильных антиоксидантов, модификацию липидного слоя клеточных мембран [28]. Направленность изменения ДК была менее очевидной. Значимое увеличение их количества при тяжелом течении COVID-19 у мужчин отмечено в лимфоцитах, а у женщин только в нейтрофилах. При этом именно в лимфоцитах мужчин с тяжелым течением COVID-19, у которых оба показателя ПОЛ (и МДА, и ДК) оказались статистически значимо повышенными, наблюдалась наиболее низкая активность СОД, т.е. в этом случае можно думать об обусловленности интенсификации ПОЛ падением способ- ности данного фермента первой линии антиоксидантной защиты осуществлять дисмутацию супероксидного анион-радикала. У женщин, у которых и при тяжелой форме COVID-19 активность СОД в лимфоцитах оставалась высокой, увеличения ДК не наблюдалось. Однако в нейтрофилах даже при относительно высокой активности СОД в группе женщин с тяжелой формой коронавирусного заболевания отмечалось увеличение и МДА, и ДК относительно показателей у больных РЛ, перенесших COVID-19 в легкой форме.

Данные, представленные в обзоре E.E. Tser-mpini et al., свидетельствуют о том, что, несмотря на более высокие уровни и активность антиоксидантных ферментов каталазы и СОД, зарегистрированные у пациентов с COVID-19, содержание ROS у пациентов было повышено и коррелировало с тяжестью заболевания [24]. Результаты наших исследований показывают, что и у больных РЛ, перенесших COVID-19, наблюдается активация СРП, степень выраженности которой повышается с увеличением тяжести перенесенной инфекции, что согласуется с выводами зарубежных исследований. При этом, согласно нашим исследованиям, интенсификация ПОЛ может происходить не только при ингибировании СОД-обусловлен-ных антиоксидантных механизмов, но и при высокой активности СОД, на что было указано в обзоре E.E. Tsermpini et al. [24].

Ведущую роль в антиоксидантной защите отводят глутатионзависимой системе [29].

По нашим данным, у мужчин при тяжелом течении коронавирусной инфекции почти двукратное снижение активности СОД в лимфоцитах сопровождалось статистически значимым увеличением уровня восстановленного глутатиона и активности ГПО по сравнению с показателями антиоксидантной защиты у больных РЛ, легко перенесших COVID-19. Это позволяет думать о возрастании роли глу-татионзависимой АС при повышении тяжести коронавирусного поражения. Недавно показано, что прооксидантные эффекты инфекции SARS-CoV-2 связаны с изменениями клеточного метаболизма и трансмембранных потоков восстановленного глутатиона и цистеина (аминокислоты, необходимой для синтеза глу- татиона) [25]. При этом легкие являются одним из органов, наиболее богатых тиолами, и считаются местом хранения пула восстановленного глутатиона клеток [30]. Изменения редокс-баланса, определяемого в основном соотношением восстановленного и окисленного глутатиона (GSH/GSSG), наблюдаются в случаях повышенного образования свободных радикалов и окислительного стресса, которые являются ключевыми патогенными факторами как острых, так и хронических заболеваний легких, включая легочные инфекционные заболевания, такие как COVID-19 [25, 31, 32]. Данные литературы указывают на то, что изменения уровня глутатиона в крови и его дезинтоксикационной функции в легких связаны с большей тяжестью клинических проявлений при COVID-19 [33].

Следует отметить, что наиболее выраженная активация ГПО наблюдалась у женщин с тяжелым течением COVID-19 – в 2,2 раза относительно легкого течения заболевания, что, возможно, объясняет снижение содержания восстановленного глутатиона, являющегося субстратом ГПО. Содержание восстановленного глутатиона в лимфоцитах женщин с тяжелым течением COVID-19 было в 1,4 раза ниже, чем при легком течении заболевания. Известно, что дефицит глутатиона в лимфоцитах влияет на связывание с ДНК ядерного фактора транскрипции NF-kB, что снижает их пролиферативный ответ на антигены и может быть одной из причин дисфункции Т-лимфоцитов при ВИЧ-инфекции [34]. В то же время у женщин основной группы, в отличие от мужчин, сохраняется высокая активность СОД, которая совместно с глутатионом образует своеобразную антиоксидантную систему [35]. Поэтому у мужчин, больных РЛ, с тяжелым течением COVID-19 при соотношении низкой СОД-активности с повышенным относительно контрольной группы уровнем восстановленного глутатиона создаются условия, при которых он может способствовать восстановлению металлов переменной валентности и молекулярного кислорода, приводящему к интенсификации СРП [34]. Более тяжелое течение коронавирусной инфекции приводит к интенсификации ПОЛ и в нейтрофилах боль- ных РЛ обоего пола, однако реакция АС в них менее выражена, чем в лимфоцитах.

Заключение. У больных РЛ, перенесших COVID-19 в тяжелой форме, вне зависимости от пола наблюдается активация СРП в лимфоцитах и нейтрофилах крови. Проведенный анализ позволяет сделать заключение о том, что изменения параметров антиоксидантной защиты в лимфоцитах женщин с РЛ при тяжелом течении COVID-19 в определенной степени можно рассматривать как адаптивные, что предположительно способствует в большинстве случаев лучшему исходу заболевания, чем у мужчин.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Кит О.И., Франциянц Е.М.

Литературный поиск, участие в исследовании, обработка материала: Горошинская И.А., Франциянц Е.М.

Статистическая обработка данных: Горошинская И.А.

Анализ и интерпретация данных: Горошинская И.А., Харагезов Д.А.

Написание и редактирование текста: Горошинская И.А., Франциянц Е.М.

Получение биохимических данных, составление рядов для их анализа: Немашкалова Л.А.

Диагностика, лечение больных, анализ клинических характеристик течения заболевания:

Харагезов Д.А., Лазутин Ю.Н., Милакин А.Г., Лейман И.А., Статешный О.Н., Пандова О.В.