Полиморфизм гена бета-лактоглобулина в стадах крупного рогатого скота

Все белки молока характеризуются наличием генетически обусловленных полиморфных вариантов, отличающихся одной или несколькими аминокислотами. Полиморфизм молочных белков был обнаружен на белковом уровне, а затем, по мере развития молекулярногенетических методов, на уровне последовательности ДНК соответствующих генов. Генотип животного по молочным белкам служит пожизненным маркером, не зависящим от изменения внешних условий и состояния организма.

Бета-лактоглобулин - представляет собой очень ценный компонент молока, необходимый для роста молодняка, поэтому является главным белком молочной сыворотки. Ген бета-лактоглобулина достаточно большой и состоит из 7-и экзонов, охватывающих около 4000 п. о. Длина цепи белка бета-лактоглобулина составляет 178 аминокислот.

Ген бета-лактоглобулина (LGB) отвечает за белковомолочность и показатель биологической ценности молока (Я.М. Хабибрахманова, 2009). Вариант LGBB связан с высоким содержанием в молоке казеиновых белков, высоким процентом жира, а вариант LGBA характеризуется высоким содержанием сывороточных белков.

В настоящее время известно 11 аллелей β -лактоглобулина, обозначенных как A, B, C, D, E, F, G, H, X, Dr и W из которых А и В являются доминантными (W.N. Eigel et al., 1984). Вариант В бета-лактоглобулина может быть принят как основной, поскольку он является наиболее частым у большинства пород. Генетические различия между ним и другим распространенным вариантом А заключаются в наличии двух аминокислотных замещений: 64 Гли → Асп и 118 Ала → Вал. Определение нуклеотидной последовательности гена β-лактоглобулина еще не закончено.

Всё выше сказанное говорит о важности изучения полиморфизма гена бета-лактоглобулина в стадах крупного рогатого скота.

Материал и методика исследований. Исследования проводились в ООО «Дусым» Атнинского района и в ГУП ГПП «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан. Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина было отобрано в ООО «Дусым» 158 черно-пёстро х голштинских коров и 70 быков-производителей в ГУП ГПП «Элита». В нашем исследовании использовались как чистопородные, так и помесные по голштинской породе быки-производители, все быки имели комплексный класс элита-рекорд.

Для проведения ДНК-диагностики и оценки по гену бета-лактоглобулина у животных были отобраны пробы крови.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

ДНК из крови выделяли комбинированным щелочным способом, оптимизированным Р.Р. Вафиным (2006): 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при -200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, содержащей буфер (60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1,5 мМ MgCl 2 , 25 мМ KCl, 10 мМ меркаптоэталол; 0,1 мМ тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, 0,2 мкл Taq ДНК полимеразы, 0,5 мкМ праймера BLGP3: 5' – GTC CTT GTG CTG GAC ACC GAC TAC A - 3', 0,5 мкМ праймера BLGP4: 5' – CAG GAC ACC GGC TCC CGG TAT ATG A - 3', сконструированных J.F. Medrano и E. Aguilar-Cordova (1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 пары нуклеотидов, 1 мкл пробы ДНК в следующем режиме:

×1:94 0С – 4 мин;

×38:94 0С – 10 сек, 60 0С – 10 сек, 72 0С – 10 сек;

×1:72 0С – 5 мин;

хранение: 4 0С.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции Hae III в 1×буфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 40 мин в 1×ТВЕ буфере.

После электрофореза гель просматривали в УФ-трансиллюминаторе при длине волны 310 нм. Идентификацию генотипов определяли по количественным и качественным признакам ПЦР ПДРФ.

В работе наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета хозяйств, то есть племенные карточки (форма 1-МОЛ, 2-МОЛ), а также каталоги и племенные свидетельства быков-производителей.

Полученные результаты в ходе научных исследований обработаны биометрическим методом с использованием ЭВМ и программного приложения Microsoft Excel.

Результаты собственных исследований. В результате исследований коров в ООО «Дусым» по локусу гена бета-лактоглобулина нами получены следующие данные. Из 158 коров: 25 коров имели генотип АА (отвечает за синтез белка А бета-лактоглобулина), 73 коровы – генотип АВ (данный генотип имеет неполное доминирование, при этом синтезируется бета-лактоглобулиновый белок, характеризующийся промежуточными свойствами и сочетающий свойства вариантов А и В белков бета-лактоглобулина), 60 коров – генотип ВВ (отвечает за экспрессию белка В бета-лактоглобулина). Частота гомозиготного генотипа АА составила 15,8%, гетерозиготного генотипа АВ – 46,2%, гомозиготного генотипа ВВ – 38,0. Частота аллеля А достигла 0,39, аллеля В – 0,61 (табл. 1).

1. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у коров

Хозяйство		n	ВВ		АВ		АА		Частота аллелей		χ2
			n	%	n	%	n	%	А	В
ООО «Дусым»	Н	158	60	38,0	73	46,2	25	15,8	0,39	0,61	0,11
	О		59	37,3	75	47,5	24	15,2

Н – наблюдаемое распределение генотипов, О – ожидаемое распределение генотипов.

Тогда как из 70 исследованных по локусу гена бета-лактоглобулина быков-производителей ГУП ГПП «Элита»: 9 (12,9%) имели генотип АА, 26 (37,1%) – генотип АВ и 35 (50,0%) быков – генотип ВВ. При этом частота аллеля А составила 0,31, а аллеля В – 0,69 (табл. 2).

2. Полиморфизм гена бета-лактоглобулина у быков-производителей

Хозяйство		n	ВВ		АВ		АА		Частота аллелей		χ2
			n	%	n	%	n	%	А	В
ГУП ГПП «Элита»	Н	70	35	50,0	26	37,1	9	12,9	0,31	0,69	1,37
	О		33	47,1	30	42,9	7	10,0

Н – наблюдаемое распределение генотипов, О – ожидаемое распределение генотипов.

Использование статистического метода Харди-Вайнберга и метода χ2 для выявления отклонений эмпирического распределения частот генотипов у коров и быков-производителей от теоретического позволили установить, что в популяциях крупного рогатого скота ООО «Дусым» и ГУП ГПП «Элита» нет статистически достоверного сдвига генетического равновесия ни по одному из трех генотипов локуса гена бета-лактоглобулина.

Изучение и оценкой полиморфизма гена бета-лактоглобулина в стадах крупного рогатого скота занимались многие исследователи. Так, частота аллеля А бета-лактоглобулина в различных стадах молочного голштино-фризского скота может варьировать от 0,37 до 0,57 (Ron et al., 1994; M.P. Sabour et al., 1996), а по черно-пестрой породе встречаемость аллеля В колеблется от 0,345 до 0,668, аллеля А от 0,332 до 0,655. В аллель -наиболее часто встречаемый вариант в европейских породах скота (K.F. Ng-Kwai-Hang, 1998), в частности в большинстве скандинавских пород крупного рогатого скота. Частоты аллеля А бета-латоглобулина у польского чернопестрого скота близка к 0,4, но в отдельных популяциях могла варьировать от 0,35 до 0,52 (K. Walawski et al., 1994).

В то же время полученные нами данные несколько отличаются от результатов других исследователей, которые указывают на более низкие значения частоты встречаемости аллеля В гена бета-лактоглобулина в стадах крупного рогатого скота.

Согласно литературным сведениям в различных зонах Российской Федерации частоты встречаемости аллелей А и В гена бета-лактоглобулина среди разных пород крупного рогатого скота также значительно различаются. Так, по данным Я.М. Хабибрахмановой (2009) в стадах крупного рогатого скота черно-пестрой, холмогорской, ярославской и симментальской пород частота встречаемости аллеля В составила 0,420,50.

Вывод . Методом ПЦР-анализа в стаде черно-пестро х голштинских коров, чистопородных и помесных по голштинской породе быков-производителей выявлено три генотипа по локусу гена бета-лактоглобулина – ВВ, АВ и АА. Частота встречаемости аллеля В составила 0,61 – 0,69%, аллеля А - 0,31 – 0,39%.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Хабибрахманова, Я. М. Полиморфизм молочных белков и гормонов крупного рогатого скота : автореф. дисс.канд.биол.наук : 06.02.01 / Хабибрахманова Язиля Аминовна. – Лесные Поляны. – 2009. – 23 с. 2. Eigel, W. N. Nomenclature of proteins of cow’s milk: fifth revision / W. N. Eigel, J. E. Butler, C. A. Ernstrom [et al.] // Journal of Dairy Science. – 1984. – P. 1599-1631. 3. Medrano, J. F. Polymerase chain reaction of bovine β-lactoglobuline genomic sequences and identification of genetic variants by RFLP analysis. / J. F. Medrano, Е. Aguilar-Cordova // Animal Biotechnology. - 1990. - №.1. - P. 73-77. 4. Ng-Kwai-Hang, K. F. Genetic polymorphism of milk proteins:Relationships with production traits, milk cjmposition and technological properties / K. F. Ng-Kwai-Hang // Animal Science. – 1998. – V. 78. – P. 131-145. 5. Ron, M. Determination of effects of milk protein genotype on production traits of Israeli Holsteins. / M. Ron [et al.] // Journal of Dairy Science, 77. – 1994. – P. 1050-1056. 6. Sabour, M. Association between milk protein genetic variants and genetic values of Canadian Holstein bulls for milk yield traits. / M. P. Sabour, C. Y. Lin, A. J.

Lee, A. J. McAllister // J Dairy Science.- 1996.- V.79. – № 6. – P. 1050-1056. 7. Walawski, K. Beta-lactoglobulin and kappa-casein polymorphism in relation to production traits and technological properties of milk in the herd of Polish Black and White cows / K. Walawski [et al.] // Genet. Pol. – 1994. – V. 35. – P. 93-108.

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА В СТАДАХ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Ахметов Т.М., Тюлькин С.В., Зарипов О.Г. Резюме

В данной работе изучен полиморфизм гена бета-лактоглобулина в стадах крупного рогатого скота, определена частота доминантных аллельных вариантов А и В. Полученные нами результаты соответствуют данным опубликованным ранее, при этом частота встречаемости аллеля В в стадах крупного рогатого скота была в пределах от 0,61 до 0,69.

BETA-LACTOGLOBULIN GENE POLYMORPHISM IN LIVESTOCK HERDS

Ahmetov T.M., Tjulkin S.V., Zaripov O.G.