Полиморфизм гена дофамин--гидроксилазы, параметры вегетативной регуляции и клинико-патологические характеристики злокачественного процесса у больных раком желудка

Медиатором симпатического отдела вегетативной нервной системы (ВНС) является норадреналин. Индивидуальные различия по параметрам симпато-парасимпатического баланса могут быть обусловлены рядом причин: особенностями синтеза норадреналина, его метаболизма, разным уровнем аффинности адренорецепторов к норадреналину. Известно, что норадреналин в норадренергических и адренергических нейронах образуется путем конверсии дофамина под влиянием фермента – дофамин-β-гидроксилазы (DBH). Семейные и близнецовые исследования показали, что большая часть межиндивидуальных различий DBH-активности в плазме крови и цереброспинальной жидкости генетически обусловлена [14, 22, 27]. Так, S.B. Ross et al. [24] обнаружили высокий уровень корреляции по DBH-плазменному уровню у монозиготных близнецов в сравнении с дизиготными. Следует отметить, что межиндивидуальные различия в активности DBH, которые обусловлены генным полиморфизмом, находятся в пределах нормы.

Среди известных полиморфизмов гена DBH можно назвать следующие: G444A, G910T, C1603T, C1912T, C-1021T, 5´-ins/del. J.F. Cubells et al. [9] приводят данные об ассоциации 5´-ins/ del полиморфизма гена DBH с DBH-активностью в плазме. В частности, делеция ассоциируется с низким уровнем DBH-активности. У американцев европеоидного происхождения с расстройствами настроения и тревожностью 444А-аллель ассоциируется с низкой DBH-активностью в цереброспинальной жидкости, 444G-аллель – с высокой [8]. В последние годы показано, что стресс-ассоциированные трансмиттеры, в частности адреналин и норадреналин, могут существенно модулировать пролиферацию и апоптоз трансформированных клеток, неоангиогенез в опухоли и тем самым вносить вклад в формирование и прогрессию злокачественных новообразований [10, 25, 28]. Изменчивость генов в пределах нормы (генетический полиморфизм), определяющая функциональные изменения белкового продукта, может служить одним из инструментов прояснения вопроса о вовлечении того или иного гена в патогенез заболевания. Одним из важных полиморфизмов, способных влиять на функцию фермента дофамин-β-гидроксилазы, ответственного за синтез норадреналина, является DBH G444A. В литературе нет указаний на исследования связи указанного полиморфизма с предрасположенностью к новообразованиям и их прогрессией.

Исследовали полиморфизм гена DBH во втором экзоне в 444 позиции ( DBH A444G ). Геномную ДНК выделяли из клеток периферической крови методом высаливания с применением протеиназы К. Генотипирование проводилось методом полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа [7]. Для определения вегетативного баланса использовали спектральный и временной анализ ритма сердца (РС) («Полиспектр», Нейрософт, г. Иваново). Статистический анализ полученных данных проводили с помощью профессионального пакета программ «Statistica for Windows» (2000, версия 6.0). Для проверки гипотез о значимости различий применялся непараметрический

U-тест Манна–Уитни (в качестве значимого рассматривали уровень вероятности p<0,05).

Результаты и обсуждение

На начальном этапе для исследования гипотезы о том, что уровень симпатической активности может выступать одним из этиопато-генетических факторов развития РЖ, проведено сравнение частоты встречаемости аллельных вариантов полиморфизма DBH A444G у больных РЖ и здоровых. Распределение генотипов соответствовало ожидаемому при соблюдении равновесия Харди-Вайнберга. Оказалось, что больные РЖ не различаются со здоровыми по частоте встречаемости аллелей G и А и по частоте встречаемости генотипов GG, AG, AA (табл. 1).

Полученные данные о равенстве частот генотипов и аллелей в группах больных РЖ и здоровых свидетельствуют о том, что изученные полиморфизмы не влияют на риск формирования РЖ. Однако известно, что факторы, определяющие этиологию и патогенез заболевания, могут различаться. Поэтому на следующем этапе мы исследовали ассоциацию полиморфизма DBH G444A с патогенетически значимыми характеристиками опухолевого процесса и отдаленными результатами лечения больных РЖ.

Ассоциацию DBH A444G полиморфизма с отдаленными результатами лечения исследовали у 47 пациентов с I–II стадией заболевания, из них от прогрессирования процесса в первый год после постановки диагноза умерло 4 человека. Оказалось, что среди не доживших до года АА-генотип в позиции 444 встречался значимо чаще, чем среди проживших более года, – 2/4 (50 %) против 4/43 (9,3 %), р=0,019 (группы сопоставимы по объему оперативного вмешательства). Сопряженности DBH полиморфизма с параметрами выживаемости при III стадии РЖ не получено. При IV стадии РЖ больные с GG-генотипом прожили значимо дольше в сравнении пациентами с АG-генотипом – 34 ± 26,5 мес против 7,5 ± 6,1 мес, р=0,004. В сравнении с пациентами с АА-генотипом у больных с GG-генотипом наблюдается схожая тенденция, но различия не достигают уровня статистической значимости – 34 ± 26,5 мес против 1,3 ± 0,6 мес, р=0,09.

Исследование ассоциации DBH A444G полиморфизма с параметрами вегетативной регу-

Частота DBH G444A генотипов и аллелей у здоровых и больных РЖ

Таблица 1

	Здоровые (n=104)	Больные РЖ (n=108)
DBH G444A генотипы
GG	28 (26,9 %)	25 (23,1 %)
AG	52 (50 %)	64 (59,2 %)
AA	24 (23,1 %)	19 (17,6 %)
	OR=1,41 (CI 0,68–2,91), р=0,32
DBH G444A аллели
G	108 (51,9 %)	114 (52,8 %)
A	100 (48,1 %)	102 (47,2 %)

ляции (по данным временного и спектрального анализа ритма сердца (РС)) показало, что у гомозигот по А аллелю значимо выше номинальное значение высокочастотной составляющей сердечного ритма (LF – «симпатическая» составляющая РС) (р=0,03) и ниже – низкочастотной (HF – «парасимпатическая» составляющая РС) (р=0,03) в сравнении с больными-носителями АG-генотипа. Различий по параметрам LF/HF-соотношения, которое характеризует симпато-парасимпатический баланс, не получено. Кроме того, у больных РЖ с АА-генотипом выявлен более высокий уровень ЧСС (р=0,007) при снижении производного от указанного параметра показателя: RRNN (р=0,01) в сравнении с пациентами с GG- и АG-генотипом. Полученные различия могут свидетельствовать о более высоком уровне симпатической активности у больных РЖ с АА-генотипом в сравнении с пациентами оппозитных групп (табл. 2).

Настоящее исследование показало взаимосвязь DBH A444G полиморфизма с параметрами вегетативной регуляции (по данным спектрального и временного анализа РС). Так, АА-генотип DBH A444G ассоциируется с высоким уровнем активности симпатического отдела ВНС.

Структурный ген, кодирующий DBH, состоит из 12 экзонов и локализуется в хромосоме 9q34. Среди описанных полиморфизмов гена DBH : G444A, G910T, C1603T, C1912T, C-1021T, 5´-ins/del. DBH A444G -полиморфизм во втором экзоне оказывает влияние на процесс мРНК-сплайсинга и не сопровождается структурными изменениями белковой молекулы, то есть оказывает влияние на скорость синтеза DBH [15] . Скорость сплайсинга, то есть скорость прохождения через ядерную мембрану, может влиять на количество белкового продукта: быстрое прохождение в цитоплазму усиливает

Полиморфизм гена DBH G 444A и параметры вегетативной регуляции у больных РЖ (M ± m)

Таблица 2

Параметры вегетативной регуляции	GG-генотип (n=25)	AG-генотип (n=64)	AA-генотип (n=19)	Р1–2	Р1–3	Р2–3
	1	2	3
TP, мс²	738 ± 132	853 ± 144	784 ± 276	-	-	-
VLF, мс²	413 ± 81	468 ± 84	376 ± 1211	-	-	-
LF, мс²	170 ± 39	213 ± 44	1861 ± 52	-	-	-
HF, мс²	153 ± 47	167 ± 31	1381 ± 61	-	-	-
LF nom, у.е.	59,9 ± 4,3	53,4 ± 2,9	65,1 ± 4,6	-	-	0,03
HF nom, у.е.	40,0 ± 4,3	46,5 ± 2,9	34,7 ± 4,6	-	-	0,03
LF/HF, у.е.	2,0 ± 0,37	1,8 ± 0,23	2,1 ± 0,4	-	-	-
VLF, %	55,3 ± 4,0	53,9 ± 2,2	57,1 ± 3,5	-	-	-
LF, %	24,3 ± 2,1	24,1 ± 1,3	26,3 ± 2,9	-	-	-
HF, %	20,1 ± 3,41	21,2 ± 2,2	14,3 ± 1,7	-	-	0,09
RRNN, у.е.	866 ± 281	856 ± 19	760 ± 33	-	0,01	0,01
SDNN, мс	24,61 ± 2,41	24,5 ± 1,9	19,5 ± 2,9	-	-	-
RMSSD, мс	17,1 ± 2,71	16,8 ± 1,3	12,2 ± 2,7	-	-	-
ЧСС, уд/мин	70,9 ± 2,41	72,2 ± 1,6	81,6 ± 3,4	-	0,007	0,007

Примечание: ТР – общая мощность спектра РС; VLF – спектральная мощность в сверхнизкочастотном диапазоне (0,0033–0,04 Гц), отражающем гуморально-метаболические или центрально-эрготропные регуляции РС; LF – спектральная мощность в низкочастотном диапазоне (0,04–0,15 Гц), отражающем влияние симпатического отдела ВНС на регуляцию РС; HF – спектральная мощность в высокочастотном диапазоне (0,15–0,4 Гц), отражающем вагусный контроль РС (колебания парасимпатического отдела ВНС) в абсолютном, процентном выражениях и нормализованных единицах (LF nom, HF nom, у.е.); RRNN – величина, обратная ЧСС; SDNN – квадратный корень стандартного отклонения всех R-R-интервалов; RMSSD – квадратный корень среднего значения квадратов разностей последовательных R-R-интервалов.

эффект и сопровождается повышением синтеза фермента, медленное – может ослаблять, так как продукт не синтезируется в «достаточном» количестве. Взаимосвязь полиморфизма гена DBH с параметрами вегетативной регуляции в литературе не описана.

В то же время ряд авторов считают, что уровень DBH в плазме крови является индикатором норадренергической и адренергической активности. Показано, что уровень DBH в плазме крови широко варьирует в популяции, но у каждого отдельного индивидуума остается стабильным в течение длительного времени и мало подвержен каким-либо влияниям, ее концентрация повышается в возрасте от 3 до 10 лет, в дальнейшем наблюдается ее снижение и остается стабильным в возрасте от 21 до 60 лет [11, 23, 26]. Экстремальные воздействия (холодовые, интенсивные физические упражнения) оказывают минимальные эффекты на уровень DBH активности в плазме, несмотря на то, что они сопровождаются повышением плазменного уровня катехоламинов, что позволяет расценивать уровень DBH в качестве индикатора длительных тенденций в уровне функциональной активности симпатического отдела ВНС [29].

В связи с тем, что большая часть межиндивидуальных различий DBH-активности в плазме крови и цереброспинальной жидкости генетически обусловлена [14, 22, 24, 29], полученные нами данные согласуются с опубликованными в литературе и расширяют представления о роли DBH в регуляции уровня симпато-парасимпатического баланса. Показана ассоциация плазменной DBH-активности с различными психиатрическими и неврологическими расстройствами [12, 16–20]. Учитывая тот факт, что норадреналин является ключевым нейромедиатором вегетативной нервной системы, регулирующей работу внутренних органов и ответственной за поддержание гомеостаза, представляется достаточно очевидным, что полиморфизм DBH гена может быть фактором, модулирующим клиническое течение различных соматических заболеваний [5, 6, 21, 26, 27]. Однако в литературе отсутствуют данные об исследовании DBH A444G полиморфизма у пациентов со злокачественными новообразованиями. Нами впервые получены данные о взаимосвязи

DBH A444G с клинико-патологическими характеристиками и отдаленными результатами лечения РЖ. У больных РЖ с АА-генотипом DBH A444G в сравнении с пациентами с GG-генотипом наблюдается более глубокая опухолевая инвазия, более частое метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов и худшие параметры однолетней выживаемости при I–II стадии РЖ.

Выводы

Впервые показана ассоциация полиморфизма гена DBH A444G с различными клиникопатологическими характеристиками РЖ и исходом заболевания. У больных РЖ с АА-генотипом DBH A444G в сравнении с пациентами с GG-генотипом наблюдается более глубокая опухолевая инвазия, более частое метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов и худшие показатели одногодичной выживаемости при I–II стадии. Полиморфизм гена DBH A444G сопряжен с различиями в уровне симпатической активности (по данным спектрального и временного анализа СР) у больных РЖ. У пациентов с АА-генотипом DBH A444G наблюдается более высокий уровень активности симпатического отдела ВНС, чем у больных с GG-генотипом. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что полиморфизм гена DBH A444G оказывает модулирующее влияние на опухолевую прогрессию при РЖ. Одним из вероятных механизмов реализации указанного влияния является его вклад в особенности функционирования ВНС, связанный с определением уровня активности симпатического отдела.