Полиморфизм гена HFE - фактор риска возникновения рака эндометрия у женщин репродуктивного возраста

Дисбаланс железа является уникальным физиологическим свойством организма женщины, которое оказывает влияние на здоровье как до менопаузы, так во время и после неё. В частности, есть основания считать, что избыток железа, как и его дефицит способны провоцировать канцерогенез [10], поскольку избыток железа индуцирует окислительный стресс, а дефицит стимулирует ангиогенез [10, 19], создавая в злокачественных клетках оптимальные условия для роста и прогрессии опухоли.

Одним из основных регуляторов гомеостаза железа является белок HFE , поддерживающий количество железа в организме на стабильном уровне. Известно, что мутации HFE (в сайтах G845A и C187G ) являются основной причиной наследственного нарушения метаболизма железа (гемохроматоза), поражающего ряд тканей и органов [6]. В широкомасштабных исследованиях показано, что биохимические показатели железа у здоровых женщин репродуктивного возраста значимо выше у носителей минорных аллелей G187 , A845 гена HFE , чем в случае генотипа дикого типа [3, 11]. Всё это позволило предположить, что существует ассоциация между полиморфными вариантами HFE ( G845A , C187G ) и повышенным риском возникновения эстрогенозависимых раков, поскольку эти заболевания этиологически связаны с эндогенным окислительным стрессом, создаваемым в тканях метаболитами эстрогенов. Перегрузка железом, обусловленная мутациями HFE , может усилить этот стресс [20]. Действительно, ранее нами и другими авторами было показано, что эстрогенозависимые раки (рак яичников и рак молочной железы) ассоциированы с полиморфными сайтами G845A и C187G HFE [1, 9, 12]. Для гена HFE показана также положительная ассоциация с колоректальным раком [16, 17].

Иванова Т . И .* – в . н . с ., к . б . н .; Крикунова Л . И . – зав . отделением , д . м . н ., проф .; Хорохорина В . А . – с . н . с ., к . б . н .; Вербинская Н . И . – врач - радиолог , к . м . н .; Мкртчян Л . С . – с . н . с ., к . м . н ; Рябченко Н . И . – зав . лабораторией , д . б . н ., проф .; Замулаева И . А . – зав . лабораторией , д . б . н ., проф .; Цыб . А . Ф . – директор , академик РАМН . ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России .

Цель данной работы – выяснить роль мутаций HFE G845A и C187G в предрасположенности к раку эндометрия (РЭ), который в подавляющем большинстве случаев является эстрогенозависимым и развивается на основе гиперплазии эндометрия (ГЭ) [5, 18]. Актуальность данной работы не вызывает сомнений, так как для спорадического рака эндометрия геномный профиль, то есть распределение SNP-аллелей (однонуклеотидных полиморфизмов), характерных для данного заболевания, ещё не разработан, хотя ведутся широкомасштабные исследования [2, 4, 8, 14].

Материалы и методы

Группу исследования составили 236 больных (160 РЭ и 76 ГЭ) в возрасте от 22 до 75 лет (табл. 1), находившихся на стационарном или амбулаторном лечении в отделении лучевых и комбинированных методов лечения гинекологических заболеваний ФГБУ МРНЦ Минздравсоцразвития России. Контрольную группу составили 112 здоровых женщин, не имевших в анамнезе гинекологических заболеваний. Клинико-морфологические показатели обследованных групп приведены в таблице 1. В момент взятия образцов периферической крови обследуемые лица подписывали форму информированного согласия на участие в исследовании, а врачом заполнялась анкета, включающая данные о возрасте, росте, весе, этнической принадлежности, диагнозе заболевания обследованных женщин. Исследование одобрено Этической комиссией МРНЦ.

У всех больных РЭ по данным биопсии диагностирована аденокарцинома. Значимых различий в возрасте между группами «контроль», «гиперплазия эндометрия» не обнаружено (p=0,689), в то время как между группами больных РЭ и здоровыми лицами различия значимы (p<0,0001). По индексу массы тела (ИМТ=m/h2) группа больных РЭ статистически значимо отличалась от групп «гиперплазия эндометрия» и «контроль» (p<0,0001). Это подтверждает ранее известный факт, что избыточный вес является фактором риска в развитии онкологических заболеваний у женщин. Значимых различий по ИМТ между группами «гиперплазия эндометрия» и «контроль» не обнаружено (р=0,689).

Таблица 1

Характеристика обследованных лиц по возрасту и индексу массы тела

Показатели	Группы
	контроль	гиперплазия эндометрия	рак эндометрия
	n=112	n=76	n=160
Возраст (mean ± SD), лет	51,65 ± 13,05	50,70 ± 10,19	55,84 ± 9,60
Min - max	22 - 87	22 - 72	20 - 75
Индекс массы тела	28,29 ± 5,13	28,63 ± 6,03	33,03 ± 7,00

В работе были исследованы полиморфные сайты C187G и G845A гена HFE , контролирующего содержание редокс-активного железа. Определялась частота генотипов HFE у больных раком эндометрия и гиперплазией эндометрия, результаты сравнили с распределением генотипов у здоровых женщин.

Материалом для работы являлась ДНК клеток периферической крови. Для генотипирования HFE использовали методику полимеразной цепной реакции с последующей обработкой специфическими рестриктазами и определением длин фрагментов рестрикции (ПЦР/ПДРФ). В ПЦР-реакцию брали 25 мкл реакционной смеси, состоящей из 50 нг ДНК, 0,5 мкмолей каждого праймера, 0,2 ммолей дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1 Ед. ХотСтар ТагПолимеразы (Qiagen) c 1-однократным буфером. Амплификаты подвергали действию рестриктазы RsaI (Promega) для определения полиморфизма G845A и BclI (Sigma) для C187G . Условия реакций соответствовали протоколам производителей ферментов рестрикции. Продукты рестрикции фракционировали посредством электрофореза в полиакриламидном геле.

Статистическая обработка

Статистический анализ проводили стандартными методами с помощью пакета программ «GraphPad Prism 5». Для обнаружения различий между выборками использовали непараметрические тесты: для двух независимых выборок – Манн-Уитни, при сравнении более чем двух независимых выборок – Крускал и Уоллис. При сравнении частот генотипов применялся точный двусторонний критерий Фишера. Вклады различных генотипов в заболеваемость определялись с помощью традиционного для исследований «случай-контроль» показателя «odd ratio» (OR – мера коррелятивной связи) и его 95 % доверительный интервал (CI).

OR = P бол (1 — Р здор ) / Р здор ( 1 — P бол ) , где Р бол - частота генотипа среди больных, Р _здор - частота генотипа среди здоровых. При отсутствии корреляций между генотипом и заболеванием OR =1. При OR > 1 риск заболевания при данном генотипе повышен.

Результаты и обсуждение

Сопоставление частоты генотипов полиморфных сайтов C187G и G845A HFE у женщин с диагнозом ГЭ, РЭ и в контрольной группе представлено в таблице 2. Анализ данных, представленных в таблице, не выявил ассоциации изучаемых полиморфизмов с развитием ГЭ и РЭ .

Частоты генотипов в группах женщин с диагнозом « рак эндометрия », « гиперплазия эндометрия » и в группе здоровых лиц

Таблица 2

Сайты	Генотипы	Число случаев (%)
		рак эндометрия	гиперплазия эндометрия	контроль
HFE	G/G	147 (92)	69 (90,8)	102 (91)
rs 1800562	G/A	12 (7,5)	7 (9,2)	9 (8)
G845A	A/A	1 (0,5)	0	1 (1)
HFE	C/C	124 (77,5)	52 (68,4)	83 (74)
rs 1799945	C/G	30 (19)	19 (25)	25 (22)
C187G	G/G	6 (3,5)	5 (6,6)	4 (4)

Учитывая, что физиологические изменения, связанные с менопаузой, наступают в среднем около 48 лет, мы разделили исследуемые группы на две подгруппы: женщины репродуктивного возраста (моложе 48 лет) и старше. В результате анализа обнаружены статистически зна- чимые различия между частотами минорных генотипов (гомозиготы и гетерозиготы по минорным аллелям 187G и 845A гена HFE) в возрастных подгруппах больных РЭ при уровне значимости р=0,0005. Среди здоровых и больных гиперплазией эндометрия женщин различия между двумя возрастными подгруппами не были статистически значимыми. Сравнение частоты минорных и диких генотипов (гомозиготы по аллелям дикого типа С187 и G845) гена HFE в пределах каждой возрастной подгруппы показано в таблице 3.

Таблица 3 Частота полиморфных генотипов HFE ( сумма гомо - и гетерозиготных носителей G187, A845 ) в двух возрастных подгруппах здоровых и больных

( рак эндометрия , гиперплазия эндометрия ) женщин

Генотип*	Рак эндометрия		р
	≤ 48 лет	≥48 лет
mut HFE wt HFE	18 (56 %) 14 (44 %)	30 (23 %) 98 (77 %)	0,0005
	Гиперплазия эндометрия
mut HFE wt HFE	13 (37 %) 22 (63 %)	17 (41 %) 24 (59 %)	0,8149
	Здоровые
mut HFE wt HFE	17(37 %) 29 (63 %)	20 (30 %) 46 (70 %)	0,5415

*mut – полиморфный, wt – дикий.

Так как частота минорных генотипов HFE в возрастных подгруппах здоровых лиц статистически значимо не отличалась, эти подгруппы были объединены. В возрастных подгруппах больных ГЭ наблюдалась сходная картина, поэтому эти подгруппы были также объединены между собой. Сравнение пропорций мутантных генотипов HFE в пределах возрастных подгрупп больных раком эндометрия с группой здоровых женщин и группой больных гиперплазией эндометрия женщин показано в таблице 4.

Таблица 4 Сравнение частоты полиморфных генотипов HFE в двух возрастных группах больных раком эндометрия , больных гиперплазией эндометрия и здоровых лиц

Показатели межгрупповых различий	Рак эндометрия ≤48 лет	Рак эндометрия ≥48 лет	Гиперплазия эндометрия	Здоровые
Процент минорных	56	23	39	33
генотипов HFE	(18/32)	(30/128)	(30/76)	(37/112)
( число минорных
генотипов/сумма минорных
и диких генотипов)
P	0,0230	0,1485	0,4408
OR	2,61	0,63	1,30
95 % CI OR	1,17 - 5,81	0,36 - 1,12	0,71 - 2,38

На основании данных, представленных в таблице 4, можно сделать вывод, что для женщин репродуктивного возраста носительство полиморфного варианта гена HFE является фактором повышенного шанса возникновения РЭ (OR=2,61). Для больных РЭ старшей возрастной подгруппы ассоциаций с повышенной вероятностью возникновения заболевания, связанного с носительством полиморфного варианта гена HFE, не обнаружено. У женщин с ГЭ частота му- тантных генотипов оказалась выше по сравнению с контролем и больными раком эндометрия старшей возрастной группы, для которых различия оказались значимы (0,0256). Между больными гиперплазией эндометрия и пациентками с диагностированным до 48 лет раком эндометрия, а также контрольной группой значимых различий в распределении частот генотипов не обнаружено (0,1387 и 0,4408 соответственно).

В настоящее время не вызывает сомнений, что железо является главным металлом, приводящим к накоплению активных форм кислорода в ходе окислительно-восстановительных реакций катехоловых эстрогенов и реакции Фентона [13, 15]. Окислительно-восстановительные реакции катехоловых эстрогенов усиливаются в присутствии Fe3+. Катехоловые эстрогены восстанавливают трёхвалентное железо до двухвалентного, которое в свою очередь приводит к инициации перекисного окисления липидов в присутствии кислорода. Ранее было показано, что эстрогеновые метаболиты способны высвобождать ионы Fe2+ из ферритина, в результате чего в ткани появляются дополнительные свободные радикалы. На модели индукции рака прямой кишки эстрогенами у хомяков было показано, что повышенное содержание железа в диете приводит к ускорению эстрогенозависимого канцерогенеза [20]. Таким образом, в репродуктивном возрасте сочетание высокого уровня эстрогенов с дисбалансом железа может привести к развитию эстрогенозависимых заболеваний, в том числе раку эндометрия.

Недавно канадскими учёными было исследовано влияние полиморфизма HFE на предрасположенность к раку эндометрия [7]. Работа была проведена на 113 пациентках с диагнозом «рак эндометрия» в возрасте от 31 до 83 лет без учёта разницы физиологических особенностей между женщинами репродуктивного возраста и старше. На такой суммарной выборке ассоциации между полиморфизмом HFE и раком эндометрия не выявлено. Нами обнаружена существенная неоднородность в распределении генотипов HFE в двух возрастных подгруппах больных раком эндометрия. Это показывает, что обобщённая для всех возрастов оценка риска возникновения рака эндометрия, связанная с носительством мутантного гена HFE , была бы ошибочной. По нашим данным для женщин репродуктивного возраста носительство полиморфного варианта гена HFE является фактором повышенного риска возникновения рака эндометрия.

Выводы

• 1.    Риск развития рака эндометрия повышен для женщин моложе 48 лет, имеющих хотя бы один минорный аллель 187G или 845A гена HFE .

• 2.    У больных раком эндометрия обнаружены значимые различия в частотах полиморфного варианта гена HFE между женщинами репродуктивного и старшего возраста.

Настоящее исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации в рамках Государственного контракта № 16.512.11.2096 «Разработка метода диагностики гиперпролиферативных заболеваний органов женской репродуктивной системы на основе интеграции молекулярно-генетических и клинико-радиологических методов».