Полиморфизм гена IL-6 у больных COVID-19 русских Челябинской области

Коронавирусная болезнь 2019 года (COVID-19) представляет собой инфекционное респираторное заболевание, вызванное коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома — 2 (SARS-CoV-2), быстро распространяющимся РНК-вирусом [1]. По данным ВOЗ вирус привел к более 400 млн подтвержденных случаев заражения и более 6 млн смертельных случаев [2]. В настоящее время ведется поиск потенциальных биомаркеров заболевания, которые повысят эффективность ранней диагностики, а также позволят разрабатывать методики лечения и предупреждения распространения COVID-19.

Патофизиологический процесс, лежащий в основе COVID-19, характеризуется усиленным иммунным ответом хозяина и повышенным уровнем циркулирующих провоспалительных цитокинов, включая IL-6 [3]. IL-6 представляет собой цитокин с плейотропными функциями, варьирующими от гемопоэза и регуляции метаболизма до воспаления, аутоиммунитета и реакций острой фазы [4]. IL-6 в значительной степени способствует нарушению регуляции иммунного ответа при COVID-19, в основном действуя в двух направлениях: с одной стороны, он может снижать цитолиз, нарушая выработку IFNγ, тем самым ослабляя противовирусную защиту; с другой сторо- ны, он может ингибировать дифференцировку регуляторных Т-клеток, вызывать стимулирование ответа Th2, а также вызывать Th17-подобную поляризацию CD4+ Т-клеток, что приводит к неконтролируемому гипервоспалению [5]. IL-6 играет решающую роль в иммунопатогенезе COVID-19, что подтверждается данными многочисленных исследований, сообщающих о повышении концентрации этого цитокина в сыворотке, прежде всего, в тяжелых случаях [5].

Различные эффекты IL-6 связаны с концентрацией цитокина, определяемой полиморфизмами гена. Ген, кодирующий IL-6, расположен на хромосоме 7p21. В настоящее время широко исследуется полиморфизм в промоторной области гена IL-6 (–174)*C/G, который приводит к замене гуанина (G) на цитозин (С) в позиции –174. Согласно литературным данным, аллель G отвечает за более высокую продукцию IL-6, в то время как гомозиготность по аллелю С (генотип С/С) — за низкую [6]. Полиморфизмы гена IL-6, связанные с уровнями IL-6 в сыворотке, ассоциированы с неблагоприятными клиническими последствиями COVID-19, включая госпитализацию в отделение интенсивной терапии (ОИТ), острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС) и смерть [7]. Таким образом, изучение полиморфизмов гена IL-6 может дать представление о межиндивидуальных вариациях риска заболевания и лежащего в его основе патогенеза.

Цель работы

Оценить особенности частоты встречаемости полиморфизма гена IL-6 у больных COVID-19 русских Челябинской области.

Материалы и методы

Исследуемую группу составили 124 больных COVID-19 русской национальности — пациенты противоковидных больниц города Челябинска. В контрольной выборке — 218 потенциально здоровых донора ГБУЗ «Челябинская областная станция переливания крови» русской популяции. Популяционная принадлежность определялась по данным генеалогического анамнеза до третьего поколения (согласно рекомендациям 8-го Международного симпозиума в 1980 г., Лос-Анджелес, США). Для сравнительного анализа между больными с разными формами COVID-19 мы разделили больных на 3 группы по тяжести течения заболевания. Больные в группах со средней и высокой степенью тяжести имели двустороннюю пневмонию (по данным компьютерной томографии подтверждена 1-2-я степень поражения легких). Больные с легкой формой имели антитела (без вакцинации), но не имели выраженных клинических признаков заболевания.

В качестве биологического материала для исследования использовалась венозная кровь, взятая в пробирки с 0,5 %-м раствором калиевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Выделение ДНК проводили с использованием реагентов PROTRANS DNA Box 500 согласно инструкции производителя (Protrans, Germany).

Для выявления SNP IL-6 (–174)*C/G выполняли аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с реактивами ООО НПФ «Литех» (г. Москва). Для амплификации использовали прибор «Терцик» НПФ «ДНК-Технология». Интерпретацию результатов проводили с помощью электрофоретической детекции в 3 %-м агарозном геле.

Статистическая обработка

Для расчета достоверности различий по частоте встречаемости аллельных вариантов, генотипов между группами русских здоровых и больных COVID-19 использовали программу PAST (v. 3.16; Hammer et al., 2001), в которой проводилась оценка критерия Пирсона ^{χ 2} с помощью анализа четырехпольной таблицы. Вероятность возникновения признака в исследуемой группе в зависимости от носительства определенного аллельного варианта, генотипа оценивали критерием отношения шансов (OR) с расчетом 95 %-го доверительного интервала (ДИ). Оценка достоверности различий в распределении частот аллелей и генотипов и соответствие закону Харди-Вайнберга проводились с использованием онлайн-приложения SNPStats.

Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р ≤ 0,05, незначимыми при р > 0,10, для промежуточных значений р (0,05 < р ≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты

На первом этапе нами был проведен анализ частоты встречаемости полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C в группе больных COVID-19 и здоровых русских Челябинской области (табл. 1). Достоверных различий между группами больных и контрольной не было обнаружено.

Таблица 1

IL-6 (–174)*G/C	Больные COVID-19 N = 124		Контрольная группа N = 218		χ²	p-Value	OR	CI
	N	%	N	%
Аллели
G	133	53,6	216	49,5	1,057	0,304	1,177	0,862	1,610
C	115	46,4	220	50,5	1,057	0,304	0,849	0,621	1,160
Генотипы
G/G	38	30,6	54	24,7	1,387	0,239	1,342	0,822	2,191
G/C	57	45,9	108	49,5	0,404	0,525	0,866	0,557	1,348
C/C	29	23,3	56	25,6	0,224	0,636	0,883	0,527	1,478

Анализ распределения частот аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C в группах больных COVID-19 и здоровых русских Челябинской области

На следующем этапе мы провели сравнительный анализ частоты встречаемости полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C среди больных COVID-19 и контрольной группы с учетом половой принадлежности.

При проведении сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C у женщин достоверные различия между группами больных и контрольной не были обнаружены. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Анализ распределения частот аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C в группах больных COVID-19 и здоровых русских Челябинской области с учетом принадлежности к женскому полу

IL-6 (–174)*G/C	Больные COVID-19 N = 60		Контрольная группа N = 89		χ²	p-Value	OR	CI
	N	%	N	%
Аллели
G	64	53,3	87	48,8	0,570	0,451	1,195	0,752	1,901
C	56	46,6	91	51,1	0,570	0,451	0,836	0,526	1,330
Генотипы
G/G	18	30	21	23,5	0,761	0,384	1,388	0,664	2,902
G/C	28	46,6	45	50,5	0,218	0,641	0,856	0,444	1,648
C/C	14	23,4	23	25,8	0,121	0,729	0,873	0,407	1,874

При проведении сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C у мужчин достоверные различия между группами больных и контрольной не были обнаружены. Результаты представлены в таблице 3.

На третьем этапе мы провели сравнение частоты встречаемости аллелей и генотипов IL-6 (–174)*G/C в трех группах больных с разными формами COVID-19: больных с тяжелой, средней и легкой клиническими формами заболевания (данные представлены в таблице 4).

Таблица 3

Анализ распределения частот аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C в группах больных COVID-19 и здоровых русских Челябинской области с учетом принадлежности к мужскому полу

IL-6 (–174)*G/C	Больные COVID-19 N = 64		Контрольная группа N = 129		χ²	p-Value	OR	CI
	N	%	N	%
Аллели
G	69	53,9	129	50	0,522	0,469	1,169	0,764	1,788
С	59	46,1	129	50	0,522	0,469	0,855	0,559	1,307
Генотипы
G/G	20	31,2	33	25,5	0,690	0,407	1,322	0,683	2,559
G/С	29	45,3	63	48,8	0,213	0,645	0,868	0,476	1,584
С/С	15	23,4	33	25,5	0,105	0,746	0,891	0,442	1,795

У больных с тяжелой и средней формами преобладает аллель IL-6 (–174)*G (56 % и 55 %), а у больных с легкой, наоборот, аллель IL-6 (–174)*C (54 %), который снижает продукцию IL-6. Анализ распределения частот аллелей IL-6 (–174)*G/C у больных с различными формами COVID-19 до- стоверных различий не выявил. У больных с легкой формой понижена частота генотипа G/G в сравнении с больными с более тяжелым течением. С группой больных с тяжелой формой различия находятся на уровне тенденции (χ2 = 2,902; P= 0,0517, OR = 0,350, 95 % CI 0,101–1,206).

Таблица 4

Распределение аллелей и генотипов полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C в группах больных COVID-19 с различными клиническими формами заболевания

IL-6 (–174)*G/C	Тяжелая N = 44		Средняя N = 56		Легкая N = 24
	N	%	N	%	N	%
Аллели
G	49	55,6	62	55,4	22	45,8
С	39	44,4	50	44,6	26	54,2
Генотипы
G/G	16	36,4	18	32,2	4	16,6
G/С	17	38,6	26	46,4	14	58,4
С/С	11	25	12	21,4	6	25

Обсуждение результатов

Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что дисбаланс в продукции IL-6 может повлиять на три основных аспекта вирусной инфекции: во-первых, на элиминацию вируса, во-вторых, на устойчивость и распространение вируса и, наконец, на хроническую вирусную инфекцию [5]. Известно, что уровень продукции зависит в том числе от полиморфизмов гена IL-6.

На первом этапе нашего исследования был проведен анализ частоты встречаемости полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C в группе больных COVID-19 и здоровых русских Челябинской области. Оценив частоту встречаемости аллеля IL-6 (–174)*G, который ассоциирован с повышенной продукцией, в контрольной группе русских Челябинской области (49,5 %), мы установили, что она соответствует среднеевропейской [4]. Известно, что самая низкая частота встречаемости аллеля IL-6 (–174)*G — в финской популяции (19 %), а самая высокая — в японской и корейской популяциях (около 100 %) [4].

По данным литературы для женщин характерны более легкое течение и низкая смертность от заболевания COVID-19 по сравнению с мужчинами, что обусловлено генетическими, а также эндокринными факторами, влияющими на иммунный ответ. Поэтому мы провели сравнительный анализ частоты встречаемости полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C среди больных COVID-19 и контрольной группы с учетом половой принадлежности. При проведении сравнительного анализа распределения аллелей и генотипов гена IL-6 (–174)*G/C у женщин и мужчин достоверные различия между группами больных и контрольной не были обнаружены.

Исследования показывают, что во время вирусной инфекции IL-6 сверхэкспрессируется, и это может оказывать потенциально неблагоприятное воздействие на иммунный ответ против SARS-CoV-2. У пациентов с COVID-19 повышенные концентрации IL-6 в сыворотке коррелируют со степенью тяжести по данным КТ [5]. Основываясь на этих исследованиях, мы провели сравнение частоты встречаемости аллелей и генотипов IL-6 (–174)*G/C в трех группах больных с разными формами COVID-19: тяжелой, средней и легкой клиническими формами заболевания. У больных с тяжелой и средней формами преобладает аллель IL-6 (–174)*G и генотип G/G, которые отвечают за повышенную продукцию цитокина, а у больных с легкой, наоборот, аллель IL-6 (–174)*C, который снижает продукцию IL-6. У больных с легкой формой понижена частота генотипа G/G в сравнении с больными с более тяжелым течением, с группой больных с тяжелой формой различия находятся на уровне тенденции. Известно, что генотип IL-6 (–174)*G/G обуславливает повышенный уровень экспрессии IL-6, что наблюдается, прежде всего, у пациентов с тяжелыми случаями, и связано с прогрессированием ОРДС и риском смерти [7].

Заключение

В данной работе представлены результаты по ассоциации генетического полиморфизма гена IL-6 (–174)*G/C с COVID-19 у русских Челябинской области. Поиск информативных биомаркеров COVID-19 в направлении полиморфизмов, которые отличаются по этнической и расовой принадлежности, перспективно со стороны создания вакцин, лекарств, предупреждающих развитие инфекции и полностью исключающих ее распространение. Необходимо продолжить исследование генных полиморфизмов цитокинов, продукты которых участвуют в иммунном ответе на COVID-19, а также рассмотреть комбинации и межгенные взаимодействия, поскольку их совместное действие может иметь различные эф- фекты, что будет способствовать развитию новых взглядов на профилактические и терапевтические подходы к данному заболеванию.