Полиморфизм гена метилентетрагидрофолатре-дуктазы (MTHFR) 677C>T у больных шизофренией: исследование «случай-контроль» в Нижегородском регионе России

GENETIC POLYMORPHISM OF METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE (MTHFR) 677C>T IN PATIENTS WITH SCHIZOPHRENIA: CASE-CONTROL STUDY IN NIZ-HEGORODSKY REGION OF RUSSIA. Sergeeva A. V.^1,2, Zhi-lyaeva T. V.¹, Blagonravova A. S.^1,2, Kasimova L. N.¹, Kuznetsov K. V.³, Golovanova V. I.³, Shebolkova T. B.³, Korshunova E. A.³ Nizhny Novgorod State Medical Academy. Minin Square 10/1, 603005, Nizhny Novgorod, Russian Federation. Research Institute of Preventive Medicine of NNSMA . Minin Square 10/1, 603005, Nizhny Novgorod, Russian Federation. N. Ya. Klimova Nizhny Novgorod Regional Blood Center. Rodionov Street 194, 603950, GSP-343, Nizhny Novgorod, Russian Federation. Background . A number of studies demonstrated that disturbances of folate metabolism, including genetic polymorphism MTHFR 677C>T, are more common in patients with schizophrenia than in the general population. Some studies have shown that carriage of the polymorphism MTHFR 677C>T in patients with schizophrenia is associated with the male gender. However, the results obtained in different geographical areas and ethnic groups differ significantly. In Russia such studies have not been conducted to date. The objective of this study was to investigate the association of genetic polymorphism MTHFR 677C>T with schizophrenia, as well as with gender and age of patients in Nizhegorodsky Region of Russia by comparison with the control group (healthy blood donors). Methods. 150 patients diagnosed with schizophrenia and 150 healthy blood donors, comparable to patients in age and gender, were examined for the carriage of polymorphism MTHFR677C>T using PCR method. Results. The carriage of genetic polymorphism MTHFR 677C>T is more common among patients with schizophrenia than in healthy donors, but not significantly at the available number of observations (р=0.488; OR=1.205; 95% CI=0.766—1.897). The carriage of this polymorphism in male patients (n=75) is more common than in female patients (n=75, р=0.51) and male donors (n=75, р=0.32; OR=1.454, 95% CI=0.765—2.766), but also not significant. However, there were significant differences in carriage frequencies of the studied polymorphism between patients of the age group over 50 years and healthy donors of the age group over 50 years (OR=2.424, 95% CI=1.047—5.612), and also between patients of the age group over 50 years and patients of the age group less than 30 years (р=0.021). It was also found that the average age of patients with genotypes CT, TT and T allele of gene MTHFR677 is significantly higher than in patients with normal genotype CC (p=0.036), which is not observed in the group of healthy donors (p>0.05). The results suggest the need for further study of genetic polymorphism MTHFR677C>T as a risk factor for schizophrenia in representatives of the Russian population, especially over the age of 30 years. Keywords: schizophrenia, polymorphism MTHFR677C>T, folate defi.

Согласно публикациям ряда авторов, среди больных шизофренией чаще, чем в общей популяции, встречается носительство генетических полиморфизмов одного из ферментов цикла обмена фолатов – метилентетрагидрофо-латредуктазы (MTHFR). Однако результаты других исследований этого положении не подтверждают. Так, в базе данных ассоциации генетических полиморфизмов с шизофренией [] приведено 23 опубликованных контролируемых исследования ассоциации полиморфизмов MTHFR c шизофренией: из них в 11 публикациях получена статистически значимая положительная связь, при этом результаты других 11 исследований оказались отрицательными, и только в 1 работе выявлен «тренд».

Наиболее часто положительная ассоциация с шизофренией выявляется у полиморфизма гена MTHFR677C>T, при котором происходит замена цитозина на тимидин в позиции 677 кодирующей цепи ДНК. В результате снижается эффективность работы фермента MTHFR, он становится чувствительным к дефициту фолатов, поступающих алиментарно. В течение последних двух десятилетий в ряде зарубежных исследований показано, что генетический полиморфизм MTHFR677C>T среди больных шизофренией встречается чаще, чем в общей популяции [24, 10, 19]. По метаанализу J. W. Muntjewerff et al., при носительстве дефектного аллеля Т в гомозиготной форме (генотипа MTHFR677TT) вероятность заболевания шизофренией на 36 % выше по сравнению с носительством нормального генотипа MTHFR677СС [18]. Другие метаанализы включают полиморфизм MTHFR677С>T в список 16 генов – факторов риска шизофрении и 4 генов, имеющих «сильную степень эпидемиологической вероятности» в отношении этого заболевания [7].

Частота носительства полиморфизма MTHFR677C>T значительно различается среди представителей разных географических областей и этнических групп (табл. 1), что вносит определенные трудности в изучение его ассоциации с отдельными заболеваниями, в частности с шизофренией.

Таблица 1

Распределение аллелей полиморфизма MTHFR677C>T среди населения отдельных регионов РФ и зарубежных стран

Регион	Соотношение частот T:C	Авторы
Московская область, Москва	0,296:0,704	Бабунова Н. Б. [1]; Калашникова Е. А., Кокаровцева С. Н. [5]
Ростов-на-Дону	0,32:0,68	Миктадова А. В. и др. [6]
Индонезия	0,02:0,98	Botto L. D., Yang Q. [8]
Китай	0,38:0,62	Leclerc D. et al. [15]
США (латиноамериканцы)	0,55:0,45	Chowdary D. et al. [9]

По E. Zintzaras (2006), ассоциация дефекта гена MTHFR с шизофренией более выражена среди представителей монголоидной расы, чем европеоидной [24]. Исследования в Скандинавии не подтвердили связи между генотипом MTHFR677 и заболеваемостью шизофренией [12]. Японские исследователи получили противоречивые результаты и считают, что необходимы дальнейшие исследования в этой области [23]. E. C. Tan et al. показали, что среди потомков китайцев, проживающих в США, носители T-аллеля имеют больший риск по заболеваемости шизофренией [22]. В турецкой популяции гомозиготное носительство ТТ-генотипа достоверно чаще встречается среди больных шизофренией, чем среди здорового контроля (OR=2,5) [20]. В России аналогичных исследований до настоящего времени не проводилось.

A. Sazci et al. выявили, что мутантные аллели MTHFR677T и генотипы 677TT достоверно чаще встречаются среди больных шизофренией мужчин по сравнению со здоровым контролем, у женщин же достоверной разницы между больными и здоровыми в представленности этого генетического фактора не обнаружено [21]. Кроме того, в целом ряде исследований именно у мужчин обнаружены более частые биохимические нарушения, ассоциированные с этим геном: гипергомоцистеинемия и дефицит фолатов сыворотки [13, 16]. Другие недавние исследования демонстрируют, что у больных шизофренией обоих полов уровень гомоцистеина плазмы выше, чем в контрольных группах здоровых [11].

Актуальность изучения взаимосвязи полиморфизма MTHFR677C>T с шизофренией обусловлена тем, что при его носительстве биохимические нарушения в фолатном и сопряженных с ним циклах (такие как гипергомоцистеи-немия, дефицит метионина и снижение синтеза моноаминов) развиваются только в определенных средовых условиях, а именно при недостаточном поступлении с пищей витаминов группы В (прежде всего фолатов и пиридоксина) [3]. Таким образом, данный однонуклеотидный полиморфизм относится к управляемым факторам риска, поэтому в случае подтверждения его взаимосвязи с развитием шизофрении открываются возможности профилактики этого заболевания и, вероятно, коррекции отдельных симптомов [4].

Целью данного исследования было изучение ассоциации носительства генетического полиморфизма MTHFR677C>T с шизофренией, а также полом и возрастом больных в Нижегородском регионе России путем сравнения с группой контроля (здоровых доноров крови).

Материалы и методы. У 150 пациентов с диагнозом шизофрения (75 мужчин и 75 женщин) в стационарах Клинической психиатрической больницы № 1 Нижнего Новгорода и Нижегородской областной психиатрической больницы № 3 после письменного информированного согласия были собраны образцы венозной крови. Для обеспечения наибольшей репрезентативности выборки отбор пациентов производился в отделениях круглосуточного и дневного стационаров городской психиатрической больницы и стационаре больницы, обслуживающей психоневрологические интернаты. В исследование включались пациенты с установленным ранее по критериям МКБ-10 диагнозом шизофрении в возрасте от 18 до 65 лет, способные понять цели исследования, не имеющие тяжелой соматической патологии и гемотрансмиссивных инфекций (Протокол № 2 клинического исследования одобрен Локальным этическим комитетом НижГМА 21.02.2014 г.).

Производился сплошной набор всех пациентов, соответствовавших критериям включения, проходивших лечение в отделениях психиатрических стационаров во время забора биообразцов, который осуществлялся с сентября 2014 г. по июнь 2015 г. периодичностью в среднем 1 раз в месяц. На последних этапах набора материала производилась коррекция исследовательской выборки для обеспечения соотношения по параметру пола 1:1. Средний возраст в изученной выборке пациентов составил 42,14±12,28 года.

В качестве контроля отбирались экземпляры из базы образцов крови здоровых доноров Нижнего Новгорода путем сопоставления по полу и возрасту пациентам основной группы (n=150, 75 мужчин, 75 женщин, средний возраст 41,63±11,67 года). Поскольку противопоказанием к донорству крови является наличие психических расстройств и зависимостей от психоактивных веществ, а также тяжелых соматических и гемотрансмиссивных инфекций, это позволяет считать контрольную группу релевантной для данного исследования. Национальный состав выборок пациентов и здоровых доноров соответствовал национальному составу населения Нижегородского региона России: русские – 95 %, остальные национальности – менее 1 % каждая, в совокупности 5 %.

Молекулярная диагностика генетического полиморфизма MTHFR677C>T осуществлялась на базе проблемной научной лаборатории ПЦР-исследований НИИ профилактической медицины НижГМА методом ПЦР с аллель-специфичными праймерами («SNP-экспресс-РВ») и с последующей детекцией в режиме реального времени. В работе использовались тест-системы для выделения ДНК из лейкоцитов «ДНК-Экспресс-кровь» и набор для определения однонуклеотидного полиморфизма MTHFR 677С>Т (Ala222Val) производства НПФ «Литех» (г. Москва).

Статистический анализ осуществлялся на базе программ MS Excel и Statistica 6.0. Поскольку распределение полученных данных в изучаемых выборках отличалось от нормального (W-тест Shapiro-Wilk), применялись непараметрические критерии: Манна-Уитни Ю-тест (далее MWU-test) при сравнении двух групп и Крускалла-Уоллиса тест (далее KW-test) при сравнении трех групп. При оценке качественных признаков применялся анализ таблиц сопряженности с использованием критерия Хи-квадрат (далее χ2), с поправкой Йетса на непрерывность в случае анализа таблиц 2*2. Кроме того, производился расчет отношения шансов (далее OR) нахождения фактора риска в основной группе и контрольной группах с 95 % доверительным интервалом (далее ДИ).

Результаты и их обсуждение. Частота встречаемости различных генотипов и аллельных вариантов MTHFR677 в исследованных группах представлена в таблице 1.

Таблица 1

Распределение носительства разных аллелей и генотипов MTHFR677 в группах пациентов и доноров

Генотипы и аллели полиморфизма MTHFR677C>T	Пациенты		Доноры		Уровень значимости
	абс.	%	абс.	%
ТТ	11	7,3	15	10,0	р=0,380, χ2=1,936
СТ	66	44,0	55	36,7
СС	73	48,7	80	53,3
Т в гомо- и гетерозиготной формах	77	51,3	70	46,7	р=0,488, χ2=0,48
С в гомозиготной форме	73	48,7	80	53,3
Всего	150	100,0	150	100,0

Как видно из таблицы 1, достоверных различий при имеющемся числе наблюдений между больными шизофренией и здоровыми донорами не выявлено, однако имеется тенденция к большему числу носительства дефектного аллеля Т среди пациентов: OR=1,205; 95 % ДИ=0,766—1,897. Это повторяет данные, полученные в китайской этнической группе [22], и говорит о том, что, возможно, данный генетический полиморфизм играет небольшую роль в качестве фактора риска шизофрении в российской популяции, однако это требует дальнейшего изучения. Так как шизофрения является мультифакториальным полигенным расстройством, вклад отдельных генетических факторов может быть небольшим (в отдельных случаях размер эффекта может составлять 1,1—1,5 %). Поэтому, согласно представлениям T. A. Manolio et al., для изучения ассоциации таких генетических локусов с заболеваниями необходим большой объем выборок или объединение разных исследований в мета- или мегаанализах [17]. Вероятно, это справедливо в отношении генетического полиморфизма MTHFR677С>T в российской популяции.

Различия в представленности аллелей и генотипов полиморфизма MTHFR677C>T у пациенток (n=75) и доноров (n=75) в изученной выборке статистически не достоверны (χ2, p>0,05, табл. 2)

Таблица 2

Распределение носительства различных аллелей и генотипов MTHFR677 среди мужчин и женщин в группах пациентов и доноров

Генотипы и аллели полиморфизма MTHFR677C>T	Пациенты				Доноры
	Женщины		Мужчины		Женщины		Мужчины
	абс.	%	абс.	%	абс.	%	абс.	%
ТТ	6	8	5	7	9	12	6	8
СТ	30	40	36	48	27	36	28	37
СС	39	52	34	45	39	52	41	55
Т в гомо- и гетерозиготной формах	36	48	41	55	36	48	34	45
С в гомозиготной форме	39	52	34	45	39	52	41	55

Однако у мужчин носительство дефектного аллеля встречалось несколько чаще (55 % против 48 % у женщин, χ2=0,43, р=0,51). Частота встречаемости дефектного аллеля Т у женщин-пациенток аналогична таковой у женщин-доноров. В то время как у мужчин-пациентов частота носительства дефектного аллеля несколько выше, чем у мужчин-доноров (55 % против 45 % у доноров, χ2=0,96, р=0,32; OR=1,454, 95 % ДИ=0,765—2,766). Полученные данные согласуются с результатами других исследований о том, что у больных шизофренией мужчин нарушения обмена фолатов (носительство полиморфизмов фолатного обмена) встречаются чаще, чем у здоровых мужчин, в то время как у женщин аналогичных различий не обнаруживается [21]. Вероятно, для получения статистически достоверных различий требуется увеличение выборки (например, в работе Sazсi et al. было обследовано 297 больных шизофренией и 341 здоровых субъектов).

При анализе полученных данных обратили на себя внимание различия среднего возраста в подгруппах пациентов с различными аллелями и генотипами изучаемого полиморфизма. Так, средний возраст пациентов в подгруппе носителей дефектного аллеля Т (генотипы СТ и ТТ) достоверно выше (44,2±12,5 года), чем в группе носителей нормального генотипа (39,9±11,7 года, р=0,036, MWU-test). У носителей разных генотипов (ТТ, СТ, СС) различия по возрасту также статистически значимы (p=0,0379, КW-test).

Как показано в диаграмме 1 (здесь и далее в диаграмме 2 даны обозначения: Mean – среднее, SE – стандартная ошибка среднего, SD – стандартное отклонение), чем больше дефектных аллелей Т имеется в генотипе, тем старше средний возраст пациентов в подгруппе. У доноров различий среднего возраста в подгруппах лиц с носительством разных аллелей и генотипов полиморфизма MTHFR677C>T не выявлено (диаграмма 2).

Диаграмма 1. Средний возраст в подгруппах пациентов с го о

£0

различными генотипами MTHFR677C>T

СС СТ ТТ

Генотипы

□ Mean □ ±SE ZE ±SD

Диаграмма 2. Средний возраст в подгруппах доноров с различными генотипами MTHFR677C>T 56 54 52 50 48 46 44 42 40 s 38

СС

СТ ТТ

Генотипы

□ Mean zz ±SE

Носительство дефектного аллеля Т и генотипов ТТ, СТ в различных возрастных группах пациентов представлено неравномерно. Так, обнаружено, что среди пациентов старшей возрастной группы (более 50 лет) совокупное носительство аллеля Т, а также носительство отдельных генотипов ТТ и СТ встречается достоверно чаще, чем среди пациентов младшей возрастной группы (до 30 лет) (табл. 3).

Аналогичных различий у доноров не выявлено (табл. 4).

Таблица 3

Распределение носительства различных аллелей и генотипов MTHFR677 в старшей и младшей возрастных группах пациентов

Генотипы и аллели полиморфизма MTHFR677C>T	Старше 50 лет		Младше 30 лет		Уровень значимости
	абс.	%	абс.	%
ТТ	5	10,6	1	2,9	χ2=6,96 p<0,05
СТ	27	57,5	13	37,1
СС	15	31,9	21	60,0
Т в гомо- и гетерозиготной формах	32	68,1	14	40,0	χ2=5,34 р=0,021
С в гомозиготной форме	15	31,9	21	60,0
Всего	47	100,0	35	100,0

Таблица 4

Распределение носительства различных аллелей и генотипов MTHFR677 в старшей и младшей возрастных группах доноров

Генотипы и аллели полиморфизма MTHFR677C>T	Старше 50 лет		Младше 30 лет		Уровень значимости
	абс.	%	абс.	%
ТТ	3	6,4	2	5,7	χ2=0,02 p>0,05
СТ	19	40,4	14	40,0
СС	25	53,2	19	54,3
Т в гомо- и гетерозиготной форме	22	46,8	16	45,7	χ2=0,02 р=0,9
С в гомозиготной форме	25	53,2	19	54,3
Всего	47	100,0	35	100,0

Как видно из таблиц 3 и 4, соотношение носительства дефектного аллеля, генотипов ТТ, СТ изучаемого полиморфизма и носительства нормального генотипа СС отличается от остальных подгрупп именно у пациентов старше 50 лет.

Выявленные различия носительства дефектного аллеля Т у пациентов старшей возрастной группы (более 50 лет) с донорами того же возраста находятся на границе статистической значимости: 32/47 и 22/47 соответственно (χ2=3,53, р=0,0605), OR=2,424 (95 % ДИ=1,047— 5,612).

Полученные возрастные особенности распределения полиморфизма MTHFR677C>T среди больных шизофренией позволяют предполагать, что данный генетический фактор повышает риск развития шизофрении в возрасте старше 30 лет, благодаря чему именно в старшей возрастной группе пациентов накапливается носительство дефектного аллеля Т и генотипов TT, CT, тогда как у пациентов моложе 30 лет отличий от здоровых доноров не наблюдается. Это согласуется с опубликованными ранее данными о том, что в изученной выборке средний возраст постановки диагноза шизофрении у носителей дефектного аллеля Т (генотипы CT, TT – 30,1±12,7 года) в среднем на 3,6 года больше, чем у носителей нормального генотипа СС (26,5±8,7 года) (MWU-test, Z=-1,29, р=0,197) [2].

Полученные результаты могут быть обусловлены патогенетическими закономерностями реализации носительства генетического полиморфизма MTHFR677C>T. Одно из наиболее изученных патологических последствий носительства этого полиморфизма – повышение уровня токсической аминокислоты гомоцистеина в плазме (гипергомоцистеинемия) – ассоциировано с возрастом и полом.

Так, широко известно, что средний уровень гомоцистеина плазмы в общей популяции постепенно увеличивается с возрастом от 4—5 мкмоль/л у детей до 10—12 мкмоль/л у взрослых, причем у мужчин уровень гомоцистеина, как правило, выше [14]. При этом в ряде экспериментальных работ показано, что нейротоксический эффект гомоцистеина имеет дозозависимый характер [3]. Возможно, при носительстве генетических факторов, предрасполагающих к гипергомоцистеинемии, в определенном возрасте достигается пороговый уровень гомоцистеина, при котором он начинает оказывать патогенное влияние на нейрональную ткань. Известно, что гомоцистеин и его дериваты обладают тропностью к глутаматным рецепторам нескольких типов: NMDA и метаботропным, роль которых в развитии шизофрении в настоящее время активно изучается [3].

Заключение. Таким образом, обнаружено, что средний возраст пациентов с носительством генотипов СТ, ТТ и аллеля Т гена MTHFR677 достоверно больше, чем у пациентов с нормальным генотипом СС, чего не наблюдается в группе здоровых доноров.

Выявлены достоверные отличия частоты носительства изучаемого полиморфизма у пациентов в возрастной группе старше 50 лет – как от здоровых доноров аналогичной возрастной группы, так и от пациентов младшей возрастной группы. Также показано, что среди больных шизофренией чаще, чем среди здоровых доноров, но не достоверно при имеющемся числе наблюдений встречается носительство генетического полиморфизма MTHFR677C>T. Более часто, но также статистически не значимо при имеющемся числе наблюдений носительство данного полиморфизма встречается у пациентов мужского пола по сравнению с

женщинами-пациентками и донорами-мужчинами. Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения генетического полиморфизма MTHFR677C>T в качестве фактора риска шизофрении среди представителей российской популяции, особенно в возрасте старше 30 лет.