Полиморфизм генов гормона роста, рецептора гормона роста, пролактина и рецептора пролактина в связи с яичной продуктивностью у кур породы полтавская глинистая

В современной генетике домашней птицы все большее распространение получают молекулярно-генетические методы. Будучи до недавнего времени своеобразной экзотикой, молекулярно-генетические маркеры стали обыденным инструментом при генетико-селекционных исследованиях (1). Повсеместное распространение ДНК-технологий позволило создать предпосылки для проведения селекции птицы на принципиально новом 198

уровне, учитывая все возможности, которые создаются при непосредственной работе с наследственным материалом.

В основе геномной селекции лежит изучение полиморфизма целевых генов, аллельные варианты которых связаны с продуктивными качествами животных. Аллельные варианты функциональных генов возникают в результате различных модификаций нуклеотидного состава, таких как точечные мутации (однонуклеотидный полиморфизм, single nucleotide polymorphism — SNP), инсерции/делеции (indel) и т.д. В любом случае выявление полиморфизма и последующее изучение его связи с продуктивными признаками служат основой дальнейшей направленной селекции. Все вышеизложенное в полной мере относится и к птицеводству (1).

Наиболее интересен поиск полиморфизма в генах, продукты которых участвуют в регуляции различных функций, прежде всего связанных с обеспечением роста и дифференцировки (2). К таким объектам относятся гены, кодирующие регуляторные белки, в частности гормоны. В свою очередь, физиологический эффект любого гормона напрямую зависит от его рецептора, что определяет целесообразность изучения полиморфизма генов, кодирующих как сами гормоны, так и их рецепторы.

С этой точки зрения в генетике птицы в качестве одних из наиболее перспективных генов-кандидатов для изучения полиморфизма и связи аллельных вариантов с продуктивными качествами птицы рассматриваются гены гормона роста, пролактина, а также их рецепторов (3, 4).

Гормон роста и пролактин относятся к классу пептидных гормонов с широким спектром регулируемых функций (5). Так, гормон роста принимает непосредственное участие в регуляции роста и дифференцировки различных типов тканей организма. Наряду с этим пролактин у птиц принимает участие в регуляции репродуктивного цикла, будучи своеобразным инициатором проявления насиживания (увеличение концентрации плазматического пролактина приводит к постепенному снижению интенсивности, а затем и к полному прекращению яйцекладки) (6, 7).

Ген гормона роста ( GH ) , расположенный в 27-й хромосоме, содержит 5 экзонов, 4 интрона при общей длине ~ 4,35 т.п.н. Показано наличие различных SNP (G662A, T3094C, C3199T и т.д.) в разных участках гена (интроны, экзоны и т.д.) (8). Выявлена связь аллельных вариантов с продуктивными признаками (яичная и мясная продуктивность) (9). Отмечена позитивная корреляция SacI+ аллеля (4-й интрон) с показателями резистентности к болезни Марека, в свою очередь MspI-полиморфизм в 1-м интроне связан с яичной продуктивностью птицы (10, 11).

Ген рецептора гормона роста ( GHR ) содержит 10 экзонов и 9 интронов, общая длина — ~ 130,33 т.п.н., расположен в Z-хромосоме, что определяет его гемизиготное состояние у самок птицы. Показано наличие нескольких различных типов SNP (G565A, A1512T и т.д.), затрагивающих интронную и экзонную части, а также нетранслируемые 5‘- и 3‘-участки гена (8, 12, 13). Выявлена связь аллельных вариантов гена GHR с показателями качества скорлупы, живой массы, а также с карликовостью кур.

Ген пролактина (PRL) включает 5 экзонов и 4 интрона, общая длина --6,14 т.п.н., находится во 2-й хромосоме. Показан полиморфизм по наличию инсерции в промоторном участке гена, а также несколько SNP (14, 15). Выявлена связь различных аллельных вариантов гена пролактина с показателями яичной продуктивности у кур разных пород, с проявлением насиживания и т.д. Например, наличие инсерции размером 24 п.н. положительно коррелирует с повышенной яйценоскостью и отрицательно — с проявлением насиживания (16). В гене пролактина описана транзиция цитозина в тимин в положении -2402, установлена положительная связь яйценоскости с CC-генотипом (17). В целом, принимая во внимание важную роль пролактина в регуляции репродуктивного цикла птицы, можно отметить особые перспективы изучения полиморфизма этого гена, в первую очередь в связи с яичной продуктивностью (18).

Ген рецептора пролактина ( PRLR ) содержит 12 экзонов, 11 интронов, общая длина составляет ~ 20,89 т.п.н., расположен, как и ген рецептора гормона роста, в Z-хромосоме. Показано наличие SNP в различных участках гена и их связь с продуктивными признаками кур. Так, аллельный вариант BamHI+ по 5-му экзону гена положительно коррелирует с яичной продуктивностью (3).

В Украине не проводилось исследований связи между полиморфизмом перечисленных генов и продуктивными качествами кур отечественной селекции, что во многом определяет актуальность и новизну выполненной работы.

Исходя из вышеизложенного, цель представляемой работы заключалась в изучении генетической структуры популяции у кур породы полтавская глинистая по локусам гормона роста, рецептора гормона роста, пролактина, рецептора пролактина, а также в выявлении связи между аллельными вариантами перечисленных генов и яичной продуктивностью.

Методика. Для проведения исследований была использована птица украинской селекции — куры яично-мясные породы полтавская глинистая, линия 14 ( n = 98), содержащиеся в лабораторном виварии опытной станции. ДНК выделяли из образцов крови, которые отбирали из гребня с помощью скарификатора на стерильную фильтровальную бумагу. Каждый образец подсушивали, маркировали и индивидуально упаковывали для предотвращения контаминации. При выделении ДНК пользовались коммерческим набором реагентов «ДНК-сорб-В» («АмплиСенс», Россия). Успешное выделение необходимой для анализа ДНК оценивали с помощью электрофореза в 0,7 % агарозном геле (CSL-AG100, «Cleaver Scientific», Великобритания) при 200 V в течение 5 мин.

Ген пролактина изучали по двум показателям — наличию инсер-ции размером 24 п.н. в промоторном участке гена (24 indel) и однонуклеотидному полиморфизму (транзиция цитозина в тимин) в положении -2402 (C-2402T) (эндонуклеаза рестрикции AluI). В гене рецептора пролактина оценивали BamHI-полиморфизм в 5-м экзоне. Ген гормона роста, как и в случае пролактина, исследовали по двум показателям — MspI-полиморфизму в 1-м интроне и SacI-полиморфизму в 4-м интроне. В гене рецептора гормона роста определяли транзицию цитозина в тимин в 5-м интроне (эндонуклеаза рестрикции NspI).

При амплификации были использованы следующие нуклеотидные последовательности праймеров: для PRL (24 indel) — 5 ‘ -TTTAA-TATTGGTGGGTGAAGAGACA-3 ’ и 5 ‘ -ATGCCACTGATCCTCGAAAACTC-3 ‘ (14); для PRL (C-2402T) — 5 ‘ -AGAGGCAGCCCAGGCATTTTAC-3 ‘ и 5 ‘ -CCTGGGTCTGGTTTGGAAATT-3 ’ (14); для GH (1-й интрон) — 5 ‘ -ATCC-CCAGGCAAACATCCTC-3 ’ и 5 ‘ -CCTCGACATCCAGCTCACAT-3 ‘ (19); для GH (4-й интрон) — 5 ‘ -CTAAAGGACCTGGAAGAAGGG-3 ‘ и 5 ‘ -AACTTGTC-GTAGGTGGGTCTG-3 ’ (11); для PRLR (5-й экзон) — 5 ‘ -TTGTCTGCTTTGA-TTCATTTCC-3 ’ и 5 ‘ -TGCATTTCATTCTTCCCTTTTT-3 ‘ (3); для GHR (5-й интрон) — 5 ‘ -ACGAAAAGTGTTTCAGTGTTGA-3 ‘ и 5 ‘ -TTTATCCCGTGTTCT-CTTGACA-3 ’ (20).

ПЦР проводили с использованием реагентов DreamTaq PCR Master Mix («Thermo Scientific», США) с помощью программируемого термо-200

циклера Терцик («ДНК-технология», Россия) по соответствующим программам: один цикл — денатурация 5 мин при 94 °C; 35 циклов — денатурация 45 с при 94 °C, отжиг 45 с при 54 °C для PRL (24 indel), 62 °C для PRL (C-2402T), 56 °C для PRLR (5-й экзон) и GH (4-й интрон), 55 °C для GH (1-й интрон) и 60 °C для GHR (5-й интрон), элонгация 60 с при 72 °C; один цикл — финальная элонгация 10 мин при 72 °C. Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, концентрация праймеров для каждого локуса — 0,2 мкМ.

Обработку амплифицированных фрагментов эндонуклеазами рестрикции проводили согласно прилагаемым инструкциям (FastDigest, «Thermo Scientific», C0A). Продукты рестрикции разделяли в 1,5 % агарозном геле (CSL-AG100, «Cleaver Scientific», Великобритания) при напряжении 150 V в течение 40 мин. Визуализацию проводили с использованием бромистого этидия в ультрафиолетовом свете. Размер рестрикционных фрагментов определяли с использованием маркеров молекулярных масс М-50 и М-100 («ИзоГен», Россия).

Для генотипирования особей по каждому из локусов сопоставляли длины рестрикционных фрагментов на электрофореграммах.

На основе полученных данных рассчитывали фактическое (O) и теоретическое (E) распределение генотипов, частоты генотипов и аллелей, соответствие генетическому равновесию популяции по Харди-Вайнбергу методом х ², фактическую (H_o) и теоретическую (H_e) гетерозиготность, общее число аллелей (Na), эффективное число аллелей (n_e), индекс фиксации Райта (Fis) согласно общепринятым методикам (21). Также проводили учет показателей яичной продуктивности кур: En₁₂ и Ещ₀ (egg number) — число яиц соответственно за 12 и 40 нед продуктивного периода; Ew₃₀ и Ew₅₂ (egg weight) — масса яйца соответственно на 30-й и 52-й нед жизни.

Достоверность различий определяли с использованием t -критерия Cтьюдента (22).

Резуёътаты. Известно, что в локусе PRL (24 indel) аллель I содержит инсерцию размером 24 п.н., в то время как аллель D ее не содержит. Генотип II представлен на электрофореграмме фрагментом размером 154 п.н., DD — 130 п.н., ID — 130 и 154 п.н. В случае PRL (C-2402T) аллель C имеет три сайта рестрикции для AluI (два мономорфных и один полиморфный), аллель T — два. Cледовательно, генотип CC представлен на электрофореграмме набором фрагментов размером 160, 144, 81 и 54 п.н.; TT — 304, 81 и 54 п.н.; CT — 304, 160, 144, 81 и 54 п.н. Наличие того или иного аллеля определяется присутствием цитозина или тимина в сайте рестрикции. У гена GH (1-й интрон) возможны три аллеля. Для аллеля A характерно наличие одного сайта рестрикции, для аллеля B — двух, C — трех. Генотип AA представлен на электрофореграмме фрагментами размером 539 и 237 п.н., BB — 392, 237 и 147 п.н., CC — 267, 237, 147 и 125 п.н., AB — 539, 392, 237 и 147 п.н., AC — 539, 267, 237, 147 и 125 п.н., BC — 392, 267, 237, 147 и 125 п.н. Ген GH (4-й интрон) существует в виде двух аллелей — A и B. Аллель A несет два сайта рестрикции для SacI (полиморфный и мономорфный сайты), аллель B — один (мономорфный сайт). Генотип AA представлен фрагментами рестрикции размером 584, 440 и 144 п.н.; BB — 1024 и 144 п.н., AB — 1024, 584, 440 и 144 п.н. У PRLR (5-й экзон) имеется аллель A, который содержит один сайт рестрикции для BamHI, и аллель B, который его не содержит. Генотип A0 представлен на электрофореграмме фрагментами размером 195 и 55 п.н., B0 — 250 п.н. У гена GHR (5-й интрон) имеется аллель B с одним сайтом рестрикции для NspI и аллель A, у которого он отсутствует. Генотип A0 представлен на электрофореграмме фрагментом размером 750 п.н., B0 — фрагментами 200 и 550 п.н.

Проведенные исследования показали, что в популяции кур породы полтавская глинистая локусы гена гормона роста (по 1-му и 4-му интронам), рецептора гормона роста и пролактина (C-2402T) поли- морфны, в то время как 24 indel и морфны (рис.).

ген рецептора пролактина — моно-

PRL (24 indel)

PRL (С-2402Т)

GH (1-й интрон)

GH (4-й интрон)

PLRR

GHR

Электрофореграмма продуктов амплификации премоторного участка гена пролактина PRL 24 indel, продуктов рестрикции фрагмента гена пролактина PRL C-2402T, 1-го интрона гена гормона роста GH , 4-го интрона гена гормона роста GH , 5-го экзона гена рецептора пролактина PRLR и 5-го интрона гена рецептора гормона роста GHR в популяции кур породы полтавская глинистая : 1-10 — номера лунок; М — маркер молекулярных масс (M-50, M-100, «ИзоГен», Россия); II , ID , DD , CC , CT , TT , AA , AB , AC , BB , A0 , B0 — соответствующие генотипы (виварий Государственной опытной станции птицеводства Национальной академии аграрных наук Украины, Харьковская обл., 2013 год).

В случае с 24 indel в популяции кур породы полтавская глинистая наблюдали наличие особей только одного генотипа DD (то есть по наличию инсерции в промоторном участке гена локус пролактина мономорфен). Мономорфный характер этого локуса резко отличает кур анализируемой линии от ранее изученных особей из популяций пород борковская барви-стая и белый плимутрок (23).

По наличию однонуклеотидного полиморфизма в положении -2402 гена пролактина в популяции были обнаружены особи всех трех возможных генотипов (см. рис.).

По результатам оценки MspI-полиморфизма в 1-м интроне гена гормона роста в изученной популяции кур имелись особи трех (из шести возможных) генотипов — AA, AB и AC. Гомозиготных по аллелям B и C особей не обнаружили. Также в изученной популяции отсутствовали особи с генотипом BC.

В свою очередь, по SacI-полиморфизму в 4-м интроне гена гормона роста были выявлены особи двух генотипов — AB (SacI+/SacI-) и BB (SacI-/SacI-). Особей с генотипом AA (SacI+/SacI+) в исследуемой популяции мы не обнаружили.

У изученных кур ген, кодирующий рецептор пролактина, был представлен одним вариантом ( A0 ) (BamHI-полиморфизм в 5-м экзоне). Как и в случае с геном пролактина (24 indel), он оказался мономорфным.

По гену GHR в популяции имелись особи двух генотипов — A0 и B0 . Вследствие гемизиготности локусов по генам PRLR и GHR у самок птицы гетерозиготы в популяции в обоих случаях отсутствовали (см. рис.).

Анализ фактического и теоретического распределений особей разных генотипов (по всем изученным локусам) в опытной популяции кур не выявил нарушения генетического равновесия, что свидетельствует об отсутствии давления отбора.

По сравнению с популяциями других пород кур украинской селекции (белый плимутрок, борковская барвистая) (23) в изученной нами популяции имелся ряд существенных особенностей. Так, для кур яичного направления продуктивности (борковская барвистая) по локусу PRL характерна высокая частота аллеля I (содержит инсерцию), для кур мясояичного направления продуктивности (белый плимутрок) — аллеля D (не содержащего инсерции), в то время как в популяции кур породы полтавская глинистая указанный локус вообще был мономорфен (табл. 1).

1. Частота генотипов и аллелей генов пролактина ( PRL ) , рецептора пролактина ( PRLR ) , гормона роста ( GH) и рецептора гормона роста ( GHR ) в популяции кур породы полтавская глинистая (виварий Государственной опытной станции птицеводства Национальной академии аграрных наук Украины, Харьковская обл., 2013 год)

Локус      |         Генотип, его частота	|        Частота аллелей
PRL (24 indel)          DD — 1 PRL (C-2402T)         CC — 0,110; CT — 0,520; TT — 0,370 PRLR (5-й экзон)      A0 — 1 GH (1-й интрон)       AA — 0,820; AB — 0,040; AC — 0,140 GH (4-й интрон)       AB — 0,070; BB — 0,930 GHR (5-й интрон)     A0 — 0,280; B0 - 0,720	D — 1 C — 0,372; T — 0,628 A —1 A — 0,908; B — 0,020; C — 0,072 A — 0,036; B — 0,964 A — 0,280; B — 0,720

Примечание. Результаты получены с использованием ПЦР-ПДРФ анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — PCR-RFLP, restriction fragment length polymorphism) и посредством сравни тельного анализа длин амплифицированных фрагментов при изучении инсерции в локусе пролактина. Описание аллелей и генотипов см. в тексте.

При анализе MspI-полиморфизма в 1-м интроне гена гормона роста в исследуемой популяции кур был найден аллель C в гетерозиготном состоянии ( AC ), при этом его частота составила 0,072. Следует отметить тот интересный факт, что как таковой аллель C , согласно данным специальной литературы, практически полностью отсутствует в популяциях коммерческих линий, однако присутствует у некоторых аборигенных пород (19). При этом аллель C , как и в представляемой работе, найден в популяциях кур других пород украинской селекции (борковская барвистая и белый плимутрок), в которых его частота составляла 0,17 (23).

Анализ наблюдаемых и ожидаемых распределений генотипов в выборке в целом показал наличие некоторого эксцесса гетерозигот по локусам PRL (C-2402T) и GH (1-й интрон) (табл. 2). В то же время по локусу GH (4-й интрон) показатели, отражающие фактическую и теоретическую гетерозиготность, практически совпадали (соответственно 0,071 и 0,069).

• 2.    Популяционно-генетическая характеристика кур породы полтавская глинистая по изученным локусам (виварий Государственной опытной станции птицеводства Национальной академии аграрных наук Украины, Харьковская обл., 2013 год)

• 3.    Продуктивные признаки у кур породы полтавская глинистая с разными аллельными вариантами генов пролактина ( PRL ) , гормона роста ( GH) и рецептора гормона роста ( GHR ) (виварий Государственной опытной станции птицеводства Национальной академии аграрных наук Украины, Харьковская обл., 2013 год)

Локус гена	|     Na	1        Ho |	1        He        |	1 Fis |	n e
PRL (24 indel)	1				-
PRL (C-2402T, AluI)	2	0,520	0,467	- 0,113	1,876
GH (1-й интрон, MspI)	3	0,184	0,170	- 0,082	1,205
GH (4-й интрон, SacI)	2	0,071	0,069	- 0,029	1,074
PRLR (5-й экзон, BamHI)	1	-	-	-	-
GHR (NspI)	2	-	-	-	-

Примечание. Na — общее число аллелей; Н_о — фактическая гетерозиготность; H e — теоретическая гетерозиготность; Fis — индекс фиксации Райта; П е — эффективное число аллелей. Прочерк означает, что показатель не может быть рассчитан из-за мономорфности локусов ( PRL 24 indel и PRLR ) и гемизиготности ( GHR ). Результаты получены с использованием ПЦР-ПДРФ анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — PCR-RFLP, restriction fragment length polymorphism) и посредством сравнительного анализа длин амплифицированных фрагментов при изучении инсерции в локусе пролактина.

Среди полиморфных локусов наибольшее значение эффективного числа аллелей наблюдалось по гену пролактина (C-2402T) (n_e = 1,876); наименьшее (n e = 1,074) — гормона роста (SacI-полиморфизм). Таким образом, среди всех изученных генов локус пролактина (C-2402T) характеризовался самым высоким уровнем полиморфизма.

Наряду с генетико-популяционными исследованиями мы оценили яичную продуктивность у кур разных генотипов.

Генотип	Продуктивный признак
	En 12 , шт.	|       En 40 , шт.	1 EW 30 , г	EW 52 , г
CC	75,38±2,33 **	PRL 201,50±8,43	54,80±1,44 *	58,57±1,86
CT	67,04±1,34 **	192,29±3,09	50,95±0,54*	57,46±0,60
TT	67,82±1,21**	188,32±3,45	52,25±0,65	59,50±0,82
AA	67,53±1,05	GH (MspI) 191,01±2,65	51,63±0,42	58,34±0,57
AB	66,50±3,62	181,79±8,57	51,08±2,81	58,93±2,91
AC	63,00±4,40	171,50±26,05	51,27±2,34	58,94±1,33
AB	72,00±1,67*	GH (SacI) 199,00±10,13	55,02±1,52 *	58,80±1,13
BB	66,98±1,05*	187,56±2,83	51,40±0,42 *	58,42±0,53
A0	65,58±2,38	GHR 186,91±6,36	52,28±0,99	58,35±0,76
B0	68,67±0,87	189,67±2,99	51,46±0,48	57,48±1,21

Примечание. En 12 и En 40 — число яиц соответственно за 12 и 40 нед продуктивного периода; EW 30 и EW 52 — масса яйца соответственно на 30-ю и 52-ю нед жизни; MspI, SacI — эндонуклеазы рестрикции. Описание генотипов по аллельным вариантам см. в тексте.

*, ** Достоверность различий соответственно Р < 0,05 и Р < 0,01.

В связи с мономорфным характером гена пролактина по наличию инсерции в промоторном участке изучение связи аллельных вариантов с продуктивными признаками у кур породы полтавская глинистая было невозможно. При этом благодаря наличию однонуклеотидного полиморфизма в локусе PRL (C-2402T) показано, что яичная продуктивность за 12 нед у особей с генотипом CC-PRL превышала таковую у особей с генотипом TT-PRL и составила соответственно 75,38±2,33 и 67,82±1,21 шт. (P < 0,01) (табл. 3). Яичная продуктивность за 40 нед у кур с генотипом CC-PRL равнялась 201,50±8,43; TT-PRL — 188,32±3,45 шт.; эти различия были недостоверными, что во многом обусловлено небольшим числом особей с генотипом CC-PRL (11 кур) по сравнению с TT-PRL (36 кур). Данные о положительной связи генотипа CC-PRL с яичной продуктивностью у кур породы полтавская глинистая соответствуют результатам, полученным на породах кур зарубежной селекции (14, 17).

Также отмечались различия по массе яйца на 30-ю нед жизни — 54,80±1,44 г у особей с генотипом CC - PRL против 50,95±0,54 г у кур с генотипом CT-PRL (P < 0,05) (см. табл. 3).

По локусу GH (MspI-полиморфизм в 1-м интроне) значительных различий по показателям продуктивности между особями разных генотипов выявлено не было, что, вероятно, связано с отсутствием в популяции кур с генотипами BB - GH и CC - GH (мы сравнивали продуктивность особей, гомозиготных и гетерозиготных по аллелю A ) (см. табл. 3).

В то же время были показаны различия по яичной продуктивности между особями с разным генотипом вследствие SacI-полиморфизма гена GH . Так, гетерозиготные особи AB (SacI+/SacI-) характеризовались большей яичной продуктивностью, чем куры с генотипом BB (SacI-/SacI-). Тенденция к превышению показателей у гетерозиготных особей над таковыми у гомозиготных сохранялась и в случае с массой яйца на 30-ю нед жизни (см. табл. 3). По локусу GHR мы не выявили достоверных различий в показателях яичной продуктивности. Локус PRLR , как и пролактина (по наличию инсерции в промоторном участке), оказался мономорфным, что исключило возможность изучения связи между генотипом и продуктивными признаками у кур.

Итак, изучена генетическая структура популяции кур породы полтавская глинистая по локусам генов гормона роста, рецептора гормона роста, пролактина и рецептора пролактина. Показано, что гены гормона роста, рецептора гормона роста и пролактина в опытной популяции кур полиморфны. По всем изученным полиморфным локусам популяция кур породы полтавская глинистая находится в состоянии генетического равновесия по Харди-Вайнбергу. Гены пролактина (по наличию инсерции в промоторном участке) и рецептора пролактина мономорфны. Показана положительная связь генотипов по пролактину CC - PRL и гормону роста AB - GH (SacI+/SacI-) с числом яиц за 12 нед продуктивного периода и массой яйца на 30-ю нед жизни. Полученные данные можно в дальнейшем использовать для направленной селекции кур породы полтавская глинистая с целью получения потомства от желательных генотипов, что в сочетании с классическими селекционными методами позволит максимально эффективно раскрыть продуктивный потенциал птицы.