Полиморфизм митохондриальной ДНК и ишемия миокарда: ассоциация гаплогруппы Н



Голубенко М.В., Шумакова Т.В., Макеева О.А., Тарасенко Н.В., Салахов Р.Р., Шипулин В.М., Назаренко М.С. Полиморфизм митохондриальной ДНК и ишемия миокарда: ассоциация гаплогруппы Н с сердечной недостаточностью. Сибирский журнал клинической и экспериментальной медицины. 2021;36(4):70–77.

Adherence to ethical standards: informed consent was obtained from all patients. The study was approved by the Ethics Committee of Research Institute of Medical Genetics of Tomsk NRMC (protocol No. 2 from 26.03.2013). For citation: Golubenko M.V., Shumakova T.V., Makeeva O.A., Tarasenko N.V., Salakhov R.R., Shipulin V.M., Nazarenko M.S. Mitochondrial DNA polymorphism and myocardial ischemia: Association of haplogroup H with heart failure. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2021;36(4):70–77.

Исследование генетической основы многофакторных заболеваний представляет собой сложную проблему, в первую очередь, из-за высокой гетерогенности как со стороны фенотипа, так и со стороны генотипа, а также из-за того, что в формировании подверженности многофакторным болезням ненаследственные факторы (окружающая среда и образ жизни) играют не меньшую роль, чем генотип. Тем не менее исследования в этой области идентифицируют все новые гены и генные варианты, влияющие на риск развития отдельных фенотипов и их сочетаний. Каждый из этих вариантов обычно имеет небольшой эффект, однако их совместное использование в мультигенных шкалах оценки риска помогает выявить индивидов со значительно повышенным наследственно обусловленным риском развития заболевания [1].

В патогенезе заболеваний сердечно-сосудистого континуума, в частности атеросклероза, существенную роль играет окислительный стресс, который, в свою очередь, возникает как результат действия различных физиологических факторов, одним из которых является производство активных форм кислорода в митохондриях. Окислительный стресс может приводить к эндотелиальной дисфункции, развитию атеросклероза и ишемической болезни сердца (ИБС) [2–4]. Митохондриальный геном кодирует белки комплексов дыхательной цепи и, соответственно, задействован в фундаментальных процессах энергетического обмена. Таким образом, митохондриальная ДНК может рассматриваться как кандидатный локус предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям. Высокий уровень полиморфизма мтДНК в популяциях и его географическая дифференциация, а также особенности митохондриальной генетики, такие как наследование по материнской линии и многокопий-ность митохондриального генома, усложняют задачу поиска функционально значимых вариантов. Наследование мтДНК по материнской линии в отсутствие рекомбинации приводит к последовательному накоплению мутаций в гаплотипах, что позволяет построить родословное (филогенетическое) древо этих гаплотипов. Отдельные ветви этого древа обозначены как гаплогруппы. Генотипирование мтДНК позволяет локализовать индивидуальные гаплотипы на родословном древе мтДНК человека, и принадлежность мтДНК индивида к какой-либо гаплогруппе означает, что она несет набор вариантов по сравнению с предковой последовательностью мтДНК, характерных для всех мтДНК этой гаплогруппы.

Цель исследования: анализ ассоциаций полиморфизма митохондриального генома с таким патологическим фенотипом сердечно-сосудистого континуума, как хроническая сердечная недостаточность (ХСН) у пациентов с ИБС.

Материал и методы

Группа 175 пациентов с сочетанием ИБС и ХСН не ниже II класса по классификации NYHA (New York Heart Association) была сформирована по мере поступления больных на оперативное лечение в отделение сердечно-сосудистой хирургии НИИ кардиологии Томского НИМЦ. Диагноз ИБС ставили на основании результатов клинико-инструментального обследования в соответствии с критериями Всемирной организации здравоохранения. В выборке преобладали мужчины (90%), средний возраст составил 55,4 ± 7,8 лет. У 94% пациентов в анамнезе были перенесенные инфаркты миокарда (один или несколько). Аортокоронарное шунтирование (АКШ) проведено у 87% пациентов, в том числе АКШ в сочетании с резекцией аневризмы левого желудочка – у 31% пациентов. У 50% пациентов выявлена ХСН III функционального класса, у 37% – ХСН II функционального класса, у 13% – ХСН IV функционального класса. У 41% пациентов был диагностирован сахарный диабет 2-го типа, 86% пациентов имели дислипидемию, 82% – артериальную гипертензию. У всех пациентов проведено эхокардиографическое обследование, определены индекс массы тела и содержание липидных фракций в сыворотке крови.

В качестве контрольной группы была использована популяционная выборка, сформированная из жителей г. Томска в возрасте от 22 до 74 лет численностью 424 человека (средний возраст – 47 ± 10 лет, 54% мужчин и 46% женщин). Выборка сформирована на основе образцов из биоколлекции НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ «Биобанк населения Северной Евразии». У всех индивидов было проведено эхокардиографическое исследование, определены липидный спектр в сыворотке крови и уровень глюкозы натощак, рассчитан индекс массы тела, измерено артериальное давление.

Исследование одобрено этическим комитетом НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ (протокол № 2 от 26.03.2013 г.).

Для определения и классификации генотипа мтДНК осуществляли секвенирование первого гипервариабельного сегмента D-петли мтДНК (позиции 16024–16400 по референсной последовательности) методом Сэнгера на автоматическом ДНК-анализаторе (Life Technologies) в центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского НИМЦ. Реакцию секвенирования проводили с набором флюоресцентно меченных ddNTP (Big Dye Terminators v.3.1 RR kit) по протоколу производителя (Life Technologies). После этого выполняли сравнение последовательностей ДНК обследованных индивидов с референсной последовательностью митохондриального генома человека [5] и на основе отличий от референсной последовательности определяли принадлежность выявленных гаплотипов мтДНК (митотипов) к отдельным гаплогруппам мтДНК в соответствии с принятой классификацией мтДНК [6]. Затем осуществляли генотипирование отдельных полиморфных сайтов мтДНК, приводящих к изменению сайтов рестрикции для эндонуклеаз, чтобы подтвердить принадлежность индивидуальных гаплотипов к данным гаплогруппам. Использовали последовательности праймеров и эндонуклеазы из статьи A. Torroni и соавт. [7].

В качестве митохондриальных генетических маркеров для анализа ассоциаций с фенотипами сердечно-сосудистого континуума использовали принадлежность мтДНК индивидов к основным распространенным у европеоидов гаплогруппам мтДНК (H и ее подгруппа H1, Н без Н1, HV0, J, T, U и ее подгруппы U2e, U4, U5, U-K). Сравнение частот анализируемых маркеров между больными и контролем, а также между подгруппами пациентов было проведено с помощью критерия χ2с поправкой Йейтса.

Анализ ассоциаций генетических маркеров с количественными признаками (индекс массы тела, липидный спектр крови, эхокардиографические параметры, артериальное давление) осуществляли с помощью однофакторного дисперсионного анализа, отдельно у мужчин и женщин. Если распределение отклонялось от нормального, проводили предварительное логарифмирование значений признака.

Результаты и обсуждение

Данные о распределении генотипов мтДНК, принадлежащих к различным гаплогруппам в исследованных выборках, представлены в таблице 1. Частоты гапло-групп мтДНК приведены как в общих выборках, так и отдельно для мужчин и женщин (в связи с тем, что пациентов с ИБС женского пола было всего 18 человек, расчеты для этой группы не проводили).

Таблица 1. Частоты гаплогрупп мтДНК в исследованных выборках (%)

Table 1. MtDNA haplogroup frequencies in the studied groups (%)

Выборка Sample	H (общая) Total	H* (–Н1)	H1	HV0	J	T	U (общая) Total	U2e	U4	U5	U–K
Популяция, общая, n = 424 Population, total, n = 424	38,68	26,65	12,03	3,07	7,31	9,91	24,76	1,42	2,59	12,26	4,71
Популяция, мужчины, n = 226 Population, males, n = 226	35,40	25,22	10,18	2,21	8,41	11,06	27,43	0,88	3,54	11,95	5,75
Популяция, женщины, n = 198 Population, females, n = 198	42,42	28,28	14,14	4,04	6,06	8,59	21,72	2,02	1,52	12,63	3,54
Больные ИБС, общая, n = 175 IHD patients, total, n = 175	44,57	35,43	9,14	1,14	7,43	7,43	23,43	1,14	2,29	10,86	4,57
Больные ИБС, мужчины, n = 157 IHD patients, males, n = 157	45,86	36,94	8,92	0,64	6,37	7,01	22,93	1,27	1,91	11,46	4,46

Примечание: частоты отдельных гаплогрупп приведены в процентах от общей численности выборки. Жирным шрифтом выделены значения, статистически отличающиеся ( p < 0,05) от значений в выборке мужчин из популяции.

Note: haplogroup frequencies are given as a percentage of the total sample size. The values, which statistically differ ( p < 0.05) from the values in males from the population sample are highlighted in bold.

Наиболее частой гаплогруппой мтДНК в изученных группах, как и в большинстве популяций европейского происхождения, является гаплогруппа Н: в среднем около 40% от выборки. Гаплогруппа Н далее может быть разделена на большое число подгрупп, самой частой из которых является Н1 (около 10%). В таблице 1 кроме общей частоты гаплогруппы Н приведены отдельно данные для гаплогруппы Н1 и суммарная частота остальных подгрупп Н.

Вторая по распространенности гаплогруппа мтДНК в европейских популяциях – это гаплогруппа U. Ее общая частота у русских составляет около 25%, и полученные нами данные согласуются с этими значениями. В гапло-группе U также можно выделить отдельные гаплогруппы, самая частая из которых встречается у русских – U5 (более 10%). В таблице 1 отдельно приведены данные о суб-гаплогруппах U2e, U4, U5 и U-K.

Следующие по распространенности в популяциях Европы, в частности у русских, – это гаплогруппы J и T, которые являются ветвями одного кластера и вместе составляют до 20% от численности выборок. Относительно редкой является гаплогруппа HV0, частота которой обычно не превышает 5%. Кроме этих гаплогрупп в выборках были зарегистрированы в единичных случаях редкие га-плогруппы W, I, X, а также в небольшом количестве (в сумме около 6%) различные гаплогруппы мтДНК восточноевразийского («монголоидного») происхождения: A, C, D, F, G, Z. Данные по этим редким линиям не приведены в таблице 1.

Сравнение частот гаплогрупп в общей группе пациентов и в популяционной выборке, а также в подгруппах мужчин выявило единственное статистически значимое различие: общая частота гаплогруппы Н, а также суммарная частота ее подгрупп за вычетом Н1 (обозначена в таблице как Н*) у пациентов мужчин была выше (45,86 и 36,94% соответственно), чем у мужчин в общей популяции (35,40 и 25,22% соответственно). Для гаплогруп-пы Н в целом значение критерия χ2 с поправкой Йейтса составило 4,21 (р = 0,04); отношение шансов OR = 1,55 (95% доверительный интервал (ДИ) 1,02–2,34). Для гаплогруппы Н без подгруппы Н1 χ2 = 5,51 (р = 0,02); OR = 1,74 (95% ДИ 1,12–2,70). При этом частота субга-плогруппы Н1 практически не различалась между группой пациентов и популяцией. Таким образом, принадлежность генотипа мтДНК пациента к гаплогруппе Н, за исключением Н1, можно рассматривать как возможный фактор риска развития тяжелой ХСН у мужчин с ИБС после инфаркта миокарда.

Анализ ассоциаций изменчивости количественных показателей с генотипом проводили в группе пациентов мужчин. Были проанализированы эхокардиографические параметры миокарда (толщина стенки левого желудочка, толщина межжелудочковой перегородки, конечный систолический и диастолический размер левого желудочка, фракция выброса левого желудочка), а также индекс массы миокарда, индекс массы тела, уровень общего холестерина и липидных фракций в сыворотке крови. Проведенный анализ не выявил статистически значимых ассоциаций генотипа мтДНК ни с одним из исследованных показателей.

Анализ ассоциаций в популяционной выборке отдельно для мужчин и женщин был проведен для тех же показателей, а также для уровня глюкозы натощак. Было выявлено две статистически значимые ассоциации для показателей липидного спектра, которые проявлялись только у мужчин: индивиды с мтДНК, принадлежащей к гаплогруппе Н (но не Н1) имели несколько более высокое значение уровня липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и несколько более низкое значение уровня триглицеридов (ТГ) в сыворотке крови по сравнению с представителями всех остальных гаплогрупп мтДНК (табл. 2). Отсутствие ассоциаций в группе пациентов может быть обусловлено тем, что большинство пациентов с ИБС принимают липидснижающие лекарственные препараты. Также следует отметить, что мы не можем исключить аналогичного эффекта для женщин, но небольшое число женщин в группе пациентов не позволило провести для них анализ ассоциаций с генотипом мтДНК.

Таблица 2. Ассоциации полиморфизма мтДНК с показателями липидного спектра у мужчин популяционной выборки

Table 2. Associations of mtDNA polymorphism with the parameters of blood lipid profile in men from the population sample

Показатели Trait	Гаплогруппа Н* (без Н1), n = 80 Haplogroup H* (except H1), n = 80	Остальные генотипы мтДНК, n = 125 All other mtDNA genotypes, n = 125	Уровень значимости p -value (р)
ЛПВП HDL	1,39 ± 0,34	1,28 ± 0,35	0,03
ТГ TG	5,09 ± 0,16	5,15 ± 0,18	0,02

Примечание: p – достигнутый уровень значимости при проведении дисперсионного анализа, показатель триглицеридов был логарифмирован.

Note: p – p -value for analysis of variance, HDL – high-density lipoproteins, TG – triglycerides. The TG values were in logarithmic form.

Выявленные различия в уровне липидных фракций между разными гаплогруппами мтДНК невелики, и это говорит о малой величине эффекта митохондриального генотипа в отношении изменчивости данных количественных признаков. Тем не менее, интересно, что ассоциация была выявлена с тем же генотипом (гаплогруппа Н*), что и при сравнении частот гаплогрупп в дизайне «случай – контроль». Однако в случае липидного спектра этот генотип имеет скорее благоприятный «антиатерогенный» эффект. Объяснение этого противоречия может быть связано с особенностями функционирования дыхательной цепи митохондрий. Известно, что у носителей гапло-группы H выше уровень поглощения кислорода, т. е. более эффективно работает дыхательная цепь, однако при этом производство активных форм кислорода тоже увеличивается и, как следствие, усиливается окислительный стресс [8]. ТГ являются основным источником энергии (энергетическим субстратом) в организме. ЛПВП, с другой стороны, могут обладать не только непосредственно антиатерогенным, но и антиоксидантным эффектом благодаря наличию в их составе параоксоназы и витамина Е [9]. Таким образом, выявленные ассоциации могут косвенно свидетельствовать об изменении липидного спектра при более интенсивной работе дыхательной цепи вследствие ускоренного потребления ТГ тканями и повышения уровня ЛПВП в ответ на окислительный стресс.

Обращает на себя внимание тот факт, что ассоциация патологического фенотипа с полиморфизмом мтДНК была выявлена для гаплогруппы мтДНК (Н), которая является самой частой в европейских популяциях. При этом она одна из самых эволюционно молодых: оценка возраста этой гаплогруппы составляет около 25 тыс. лет, и считается, что она была распространена в Европе еще до последнего ледникового периода. Предполагается, что носители гаплогруппы Н, пережившие этот период в «рефугиуме» на юге Европы, затем расселились по освободившейся от ледника территории [10].

Гаплогруппа Н принадлежит к крупной ветви HV на родословном древе мтДНК человека, и все мтДНК этой ветви несут нуклеотидную замену Т14766С, приводящую к замене аминокислоты Thr7Ile в цитохроме b, который входит в состав комплекса III дыхательной цепи. Гаплогруппа Н далее характеризуется заменой G2706A в гене 16S рРНК. Гаплогруппа Н1 определяется заменой G3010A в том же гене, то есть мтДНК, принадлежащие к гаплогруппе Н1, имеют обе эти замены. Сочетание этих вариантов (или каждый из них по отдельности) может оказывать влияние на вторичную структуру 16S рРНК. В частности, позиция 3010 в геномной последовательности мтДНК соответствует нуклеотиду 1340 в 16S рРНК, который образует водородную связь с нуклеотидом 1357 в одной из шпилек [11].

Кроме того, нуклеотиды 2706 и 3010 находятся в участках, кодирующих митохондриальные пептиды – сигнальные молекулы, обладающие нейропротекторными и кардиопротекторными свойствами [12]. В частности, замена G2706A в гене хуманина (24 аминокислоты, кодируется нуклеотидами 2634–2707) приводит к образованию стоп-кодона, общего с универсальным генетическим кодом, что делает возможной трансляцию этого пептида в цитоплазме (без этой замены стоп-кодон распознается только митохондриальными рибосомами). Замена G3010A входит в ген пептида SHLP6 (20 аминокислот, кодируется нуклеотидами 2992–3051), хотя она и не меняет аминокислотной последовательности этого пептида, но элиминирует CpG сайт, т. е. может иметь значение для метилирования мтДНК. Таким образом, мы видим, что частые, распространенные в европейской популяции варианты мтДНК потенциально могут влиять на функцию митохондриального генома и кодируемых им белков. Очевидно, что эффект этих вариантов не может быть большим, так как правильное функционирование митохондрий критически важно для жизни клетки. Однако даже небольшие флуктуации в клеточном гомеостазе могут иметь значение для модуляции процессов более высокого уровня.

Результаты ассоциативных и функциональных исследований подтверждают эту гипотезу. Показано, что в клетках, содержащих мтДНК гаплогруппы Н, выше продукция АТФ и АФК [13]. Отмечено, что у носителей гаплогруппы H значительно выше уровень окислительных повреждений мтДНК [8]. В российской популяции отмечено, что га-плогруппа H встречалась статистически значимо чаще у больных ИБС по сравнению с контрольной группой [14]. Ранее была выявлена ассоциация гаплогруппы H с инфарктом миокарда в молодом возрасте (до 55 лет) у курящих мужчин [15]. Более того, лица с гаплогруппой Н1 имели более высокую вероятность развития повторных сердечно-сосудистых катастроф в течение года после эпизода острого коронарного синдрома и инфаркта миокарда [16]. Н1 может быть также фактором риска ранней внезапной сердечной смерти (до 55 лет) [17]. Также была показана ассоциация гаплогруппы H с ишемической и дилатационной кардиомиопатиями [18, 19].

В популяции Финляндии в группе долгожителей гапло-группа Н встречалась статистически значимо реже, чем в группе лиц среднего возраста и в группе несовершеннолетних [20]. Также было отмечено, что среди лиц старческого возраста у татар частота гаплогруппы Н была значимо ниже [21]. Как и упомянутые исследования, полученные нами результаты свидетельствуют о неблагоприятном эффекте гаплогруппы Н мтДНК в отношении сердечно-сосудистых заболеваний в зрелом и пожилом возрасте.

В эволюционной медицине, рассматривающей болезнь как результат конфликта между современными условиями среды и геномом, несущим варианты, имев- шие селективное преимущество в прошлом, существует гипотеза так называемых «экономных» генотипов, предложенная Дж. Нилом, согласно которой генотипы, обладающие большей приспособленностью на ранних этапах эволюции человека, стали невыгодными в современном обществе, в котором нет недостатка пищи, а физическая активность у многих людей снижена. В частности, этим объясняют рост заболеваемости сахарным диабетом 2-го типа в современных популяциях [22]. К полиморфизму мтДНК, непосредственно связанной с энергетическим, углеводным и липидным обменом, также можно применить эту гипотезу: более эффективная работа дыхательной цепи, выгодная на раннем этапе развития человечества, становится фактором риска в современных условиях, для которых характерен избыток калорий в пище и недостаток физической активности [23]. Кроме того, увеличение средней продолжительности жизни способствует повышению заболеваемости, связанной с «болезнями позднего возраста», в патогенезе которых задействован окислительный стресс, и к которым относятся в том числе сердечно-сосудистые заболевания. Таким образом, преобладание гаплогруппы Н в современных европейских популяциях может быть результатом селективного преимущества в прошлом, обусловленного более эффективной работой митохондрий. Однако теперь, с изменением условий жизни, на первый план выходят отрицательные побочные эффекты этого генотипа, связанные с окислительным стрессом.

Заключение

Проведенное исследование показало, что принадлежность мтДНК к гаплогруппе Н у мужчин может являться фактором риска для осложненного течения ИБС. Таким образом, самый частый генотип мтДНК европейцев – га-плогруппа Н (за исключением Н1), по-видимому, вносит небольшой, но значимый вклад в подверженность ИБС и ее осложнению – ХСН.