Полиморфный локус rs8023580 NR2F2-AS1 ассоциирован с риском развития рака молочной железы у жителей Центральной России



Pasenov K.N., Ponomarenko I.V., Churnosov M.I. Polymorphic locus rs8023580 NR2F2-AS1 is associated with breast cancer risk in residents of Central Russia. The Siberian Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2024;39(1):156–162.

Эпидемиологические данные, полученные Международным агентством по изучению рака (International Agency for Research on Cancer) Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) на основе исследования 36 различных опухолей в 185 странах мира, показывают, что в 2020 г. во всем мире было зарегистрировано более 2,261 млн новых случаев РМЖ (11,7% от всех случаев рака) и почти 685 тыс. смертей от этого заболевания (6,9% от всех случаев рака) [1]. В течение ближайших 20 лет (с 2020 по 2040 гг.) ВОЗ (данные Global Cancer Observatory, прогнозирует значительный рост числа заболевших РМЖ среди женщин (на 39%, с 2,3 млн до 3,2 млн) и умерших от РМЖ (на 47%, с 0,68 млн до 1,00 млн).

В Российской Федерации РМЖ также является приоритетной медицинской проблемой – РМЖ занимает первое место в структуре онкологической патологии у женского населения (22,1%, 2021 г.), причем максимальные значения этот показатель имеет среди женщин в возрасте 30–59 лет (29,0%) [2]. За 10-летний период (2011– 2021) показатель заболеваемости РМЖ у женского населения РФ увеличился с 74,87 до 89,25 на 100 тыс. населения (прирост составил 18,98% при среднегодовом темпе прироста 1,72%) [2].

РМЖ с генетических позиций (близнецовые, семейные, ассоциативные, полногеномные (GWAS) исследования) активно изучается в последние десятилетия [3–5]. По этому вопросу накоплен значительный фактический материал, убедительно показывающий существенный вклад наследственных факторов (не менее 30%) в подверженность к заболеванию [4]. При этом считается, что лишь в 5% случаев заболевание связано с мутациями в высоко / умеренно-пенетрантных генах (BRCA1;BRCA2;CDH1;TP53;PTEN и др.) [4]. GWAS-значимые локусы, несмотря на их многочисленность (известно более 200 SNP), «описывают» лишь немногим более 40% предполагаемых генетических факторов риска РМЖ [5], что указывает на наличие «скрытой» наследственности (более 50% генетических факторов риска неизвестно).

В патофизиологии РМЖ большое значение имеют половые гормоны (эстрадиол, тестостерон и др.), высокие концентрации которых обусловливают и более высокий риск возникновения заболевания [6–8]. Биологические эффекты половых гормонов, значимые для РМЖ, напрямую зависят от содержания SHBG, который связывает / транспортирует их и таким образом является важнейшим «регулятором» уровня биодоступных (так называемых биологически активных) форм этих половых гормонов [8]. Концентрация циркулирующего SHBG в организме более чем на 50% определяется наследственными факторами, и к настоящему времени известен ряд GWAS-значимых локусов, ассоциированных с уровнем SHBG [9]. Результаты, полученные на основе менделевской рандомизации, демонстрируют генетические связи обратной направленности между уровнем SHBG и риском РМЖ [10]. При этом роль отдельных GWAS-значимых генетических детерминант SHBG в формировании РМЖ не изучалась, что определяет актуальность данной работы.

Цель исследования: изучить ассоциации полиморфных локусов, связанных с уровнем SHBG на полногеномном уровне значимости, с риском развития РМЖ.

Материал и методы

Работа выполнена на выборке из 1498 женщин, из которых больных РМЖ – 358 человек, контроль – 1140 индивидуумов. Выборка больных формировалась с 2010 по 2016 гг. в Белгородском областном онкологическом диспансере и включала пациенток с впервые верифицированным диагнозом «карцинома молочной железы» [11].

Морфологическая диагностика заболевания выполнялась в профильном отделении (иммуногистохимическом) Белгородского областного патолого-анатомического бюро. Контрольная группа была сформирована из женщин без клинических / анамнестических признаков РМЖ (обследование женщин проводилось в ходе профилактических осмотров, выполненных в Белгородской областной клинической больнице за тот же период времени). При формировании групп больных / контроля учитывался ряд критериев: национальность (согласно самоидентификации), место проживания и рождения; в выборки включались русские индивидуумы, проживающие (родившиеся) в Центрально-Черноземном регионе России [12]. Исключались из обследования женщины с тяжелыми соматическими заболеваниями, отказавшиеся от участия в исследовании. Все женщины-участники обследования дали информированное (письменное) подтверждение о своем участии в данном клинико-генетическом исследовании. Этический комитет НИУ БелГУ одобрил настоящее исследование.

Группы больных и контроля имели сопоставимые возрастные характеристики: РМЖ – 55,74 ± 12,79 лет (min – 28 лет; max – 84 года), контроль – 55,02 ± 12,35 лет (min – 29 лет; max – 80 лет), р = 0,17. В изучаемых группах подавляющее большинство женщин (68,16% больных и 63,60% в контроле; р = 0,13) были в постменопаузе, и лишь около 1/3 женщин имели пременопаузальный статус (31,84% больных и 36,40% в контроле). Среди больных РМЖ стадии T0–T2 имели 74%, а стадии T3–T4 – 26%. У 66% была зарегистрирована экспрессия рецеп- торов эстрогена (ER+), у 59% экспрессия рецепторов прогестерона (PR+), экспрессия HER-2 выявлена у 36%, тройной негативный молекулярный подтип наблюдался у 22%. Степень злокачественности G1/G2 была отмечена у 68% больных, G3 – у 32%. Наличие метастазов в лимфоузлах (N) наблюдалось у 53% пациенток с РМЖ.

Проведено генотипирование четырех SNP, связанных с уровнем SHBG по данным ранее выполненного GWAS [9]: rs7910927 JMJD1C , rs4149056 SLCO1B1 , rs8023580 NR2F2-AS1 , rs12150660 SHBG . Экспериментальные генетические исследования выполнены на амплификато-ре CFX96 (Bio-Rad): проводилась полимеразная цепная реакция в режиме реального времени с использованием праймеров, разработанных специально для генотипирования вышеуказанных локусов ООО «Тест-Ген» (Россия, г. Ульяновск).

При проведении генетико-статистического анализа были выполнены:

• а)    сравнительная оценка между ожидаемым и наблюдаемым (согласно равновесию Харди – Вайнберга) распределением полиморфных вариантов как среди больных, так и в контроле;

• б)    выявление ассоциаций SNP с РМЖ методом логистической регрессии в 4 моделях (аллельная; доминантная; рецессивная; аддитивная) с коррекцией на возраст изучаемых женщин и множественные сравнения (использовались пермутационные процедуры). В программе gPLINK производилось вычисление показателей OR (отношения шансов) и 95%CI (95% доверительный интервал OR). В качестве статистически достоверных считались результаты, удовлетворяющие требованию p_perm ≤ 0,05;

• в)    анализ регуляторного значения полиморфизма, показавшего значимые ассоциации с заболеванием – rs8023580 NR2F2-AS1 , в печени, являющейся основным местом образования SHBG в организме [13]. Использовались биоинформатические ресурсы QTLbase (http:// www.mulinlab.org/qtlbase/index.html ; дата обращения – 30.08.2023 г.), HaploReg ( https://pubs.broadinstitute.org/ mammals/haploreg/haploreg.php; дата обращения – 29.07.2023), GTExportal ( https://gtexportal.org/home/ ; дата обращения – 10.08.2023 г.).

Результаты

При рассмотрении фактического распределения генотипов по 4 изучаемым SNP среди больных и в контроле не выявлено достоверных отклонений от ожидаемого в соответствии с законом Харди – Вайнберга распределения – показатели p_HWE превышали значения 0,221 среди больных и 0,075 в контроле (таблица), что указывает на «достаточное» качество проведенного генотипирования и позволяет использовать в полном обьеме полученные экспериментальные генетические данные для ассоциативного анализа.

Выявлена статистически достоверная связь минорного аллельного варианта С полиморфного локуса rs8023580 NR2F2-AS1 с риском развития РМЖ согласно рецессивной генетической модели: генотип СС данного SNP является протективным фактором при возникновении заболевания ( OR = 0,58; 95% CI 0,36–0,96; р = 0,033; р_perm = 0,035) (см. табл.). Другие три изученных SHBG-значимых полиморфизма (rs7910927 JMJD1C , rs4149056 SLCO1B1 , rs12150660 SHBG ) не были ассоциированы с РМЖ.

Таблица. Распределение генетических вариантов SHBG-значимых полиморфных локусов у больных раком молочной железы и в контроле

Table. Distribution of genetic variants of SHBG-significant polymorphic loci in patients with BC and in control

S' О e;	Аллели, генотипы, генетические модели Alleles, genotypes, genetic models	Больные РМЖ, абс. (%), n = 358 Patients with BC, abs. (%), n = 358	Контроль, абс. (%), n = 1140 Control, abs. (%), n = 1140
О S	GG	92 (25,99%)	273 (25,00%)
	GT	186 (52,54%)	554 (50,73%)
	TT	76 (21,47%)	265 (24,27%)
	Р HWE	0,340	0,672
	Минорный аллель Т Minor allele Т	47,74%	49,63%
	T vs. G (1)	OR = 0,93; 95% CI 0,78–1,10; р = 0,381
	TT vs. GT vs. GG (2)	OR = 0,93; 95% CI 0,78–1,10; р = 0,375
	TT + GТ vs. GG (3)	OR = 0,95; 95% CI 0,72–1,25; р = 0,710
	TT vs. GТ + GG (4)	OR = 0,85; 95% CI 0,64–1,14; р = 0,281
£ о о со	TT	219 (62,04%)	623 (60,37%)
	TC	121 (34,28%)	355 (34,40%)
	CC	13 (3,68%)	54 (5,23%)
	Р HWE	0,521	0,721
	Минорный аллель C Minor allele C	20,82%	22,43%
	T vs. C (1)	OR = 0,91; 95% CI 0,74–1,12; р = 0,373
	CC vs. TC vs. TT (2)	OR = 0,91; 95% CI 0,74–1,12; р = 0,372
	CC + TC vs. TT (3)	OR = 0,93; 95% CI 0,73–1,20; р = 0,579
	CC vs. TC + TT (4)	OR = 0,69 , 95% CI 0,37–1,28; р = 0,244
£ 1	TT	187 (52,82%)	565 (52,03%)
	TC	147 (41,53%)	420 (38,67%)
	CC	20 (5,65%)	101 (9,30%)
	Р HWE	0,221	0,075
	Минорный аллель C Minor allele C	26,41%	28,64%
	T vs. C (1)	OR = 0,89; 95% CI 0,74–1,08; р = 0,253
	CC vs. TC vs. TT (2)	OR = 0,90; 95% CI 0,74–1,08; р = 0,257
	CC + TC vs. TT (3)	OR = 0,97; 95% CI 0,76–1,23; р = 0,794
	CC vs. TC + TT (4)	OR = 0,58; 95% CI 0,36–0,96; р = 0,033
о X со	GG	199 (56,21%)	626 (57,01%)
	GT	132 (37,29%)	391 (35,61%)
	TT	23 (6,50%)	81 (7,38%)
	Р HWE	0,888	0,078
	Минорный аллель T Minor allele Т	25,14%	25,18%
	T vs. G (1)	OR = 1,00; 95% CI 0,82–1,21; р = 0,983
	TT vs. GT vs. GG (2)	OR = 1,00; 95% CI 0,82–1,21; р = 0,982
	TT + GТ vs. GG (3)	OR = 1,03; 95% CI 0,81–1,31; р = 0,792
	TT vs. GТ + GG (4)	OR = 0,87; 95% CI 0,54–1,41; р = 0,577

Примечание: OR – отношение шансов, 95% CI – 95% доверительный интервал OR, р – уровень статистической значимости (жирным обозначены достоверные различия). Анализировались 4 генетические модели: аллельная (1), аддитивная (2), доминантная (3), рецессивная (4); для аллелей указана частота; PHWE – показатель различий между наблюдаемым и ожидаемым распределением генотипов согласно закону Харди – Вайнберга.

Note: BC – breast cancer, OR – odds ratio, 95% CI – 95% confidence interval OR, p – level of statistical significance (bold denotes significant differences). Four genetic models were analyzed: allelic (1), additive (2), dominant (3), recessive (4); frequency is indicated for alleles; PHWE is an indicator of differences between the observed and expected distribution of genotypes according to the Hardy – Weinberg law.

Материалы программы Haploreg указывают на важное регуляторное значение rs8023580 гена NR2F2-AS1 в печени (Epigenome ID-E066), являющегося основным местом образования SHBG в организме – данный полиморфизм расположен в геноме в области фракции гистоновых белков H3K4me1, которые являются белковыми маркерами таких модуляторов генной активности, как энхансеры. Кроме это, в базе Haploreg приводится информация о регуляторной «значимости» этого полиморфизма (находится в области энхансеров) в клеточных линиях карциномы печени (HepG2 Hepatocellular Carcinoma Cell Line; Epigenome ID-E118).

Согласно данным QTLbase, rs8023580 гена NR2F2-AS1 связан с уровнем метилирования участка генома cg01739960 (hg38) (chr15:96715164) в печени (карцинома печени). При этом аллельный вариант С rs8023580 на полногеномном уровнем статистической значимости ассоциирован с гиперметилированием ДНК (beta = 0,36, р = 1,62 × 10^–8).

In silico данные, размещенные в базе GTExportal, указывают на корреляцию rs8023580 NR2F2-AS1 с транскрипционной активностью гена RP11-327J17.2 в печени. Генетический вариант С rs8023580 ассоциирован с низким уровнем продукции мРНК данного гена (beta = –0,23; р = 4,60 × 10^–6).

Одним из важнейших геном-значимых потенциальных регуляторных эффектов rs8023580 NR2F2-AS1 может являться его локализация в области участков (мотивов) ДНК, взаимодействующих с шестью факторами транскрипции – Foxd1, Foxl1, Foxq1, Mef2, PLZF, STAT (данные Haploreg). Причем генетический вариант С rs8023580 NR2F2-AS1 определяет низкую аффинность мотивов ДНК к подавляющему числу (5 из 6) из вышеуказанных факторов транскрипции – Foxd1 (показатель различий в аффинности к фактору транскрипции аллелей С и Т составляет –12,0), Foxl1 (–3,4), Foxq1 (–11,8), Mef2 (–11,9), PLZF (–1,0); лишь к одному фактору транскрипции – STAT (+2,1) – данный аллельный вариант повышает «чувствительность» мотива ДНК. Согласно базе данных Gene Ontology, шесть факторов транскрипции, на взаимодействие которых с ДНК влияет rs8023580 NR2F2-AS1, относятся к группе факторов транскрипции типа «спираль – виток – спираль» ( p_fdr = 0,0008), находятся в cis-регуляторной области РНК-полимеразы II, специфичной для последовательности связывания ДНК ( p_fdr = 0,018), определяют активность ДНК-связывающих факторов транскрипции, специфичных для РНК-полимеразы II ( p_fdr = 0,012), вовлечены в процессы клеточной дифференцировки ( p_fdr = 0,034) и развития тканей ( p_fdr = 0,006).

Обсуждение

В настоящем исследовании показана связь GWAS-значимого для SHBG полиморфного локуса rs8023580 NR2F2-AS1 с РМЖ. Генотип СС rs8023580 NR2F2-AS1 является протективным фактором развития опухоли ( OR = 0,58). SNP rs8023580 NR2F2-AS1 «показал себя» функционально значимым в печени: локализован в регионе энхансеров, влияет на уровень метилирования участка генома cg01739960 и экспрессию гена RP11-327J17.2, определяет взаимодействие ДНК с шестью факторами транскрипции (Foxd1, Foxl1, Foxq1, Mef2, PLZF, STAT). РМЖ-протективный генетический вариант С rs8023580 NR2F2-AS1 связан с гиперметилированием участка генома cg01739960 (hg38), низкой экспрессией гена

RP11-327J17.2 , обусловливает пониженную аффинность ДНК к подавляющему большинству факторов транскрипции (за исключением STAT).

В ранее выполненном GWAS показана ассоциация rs8023580 NR2F2-AS1 с уровнем SHBG у женщин, причем с низким содержанием SHBG был связан «мажорный» аллель Т этого SNP (beta = 0,038); соответственно, высокий уровень SHBG маркируется альтернативным для этого аллеля минорным генетическим вариантом С данного полиморфизма [9]. Таким образом, согласно нашим данным, SHBG-повышающий генетический вариант С rs8023580 NR2F2-AS1 является протективным фактором возникновения РМЖ.

Наши результаты соответствуют данным ранее проведенных исследований по этой теме. Так, в масштабных исследованиях N.L. Dimou и соавт. [10], F. Chen и соавт. [7], выполнивших менделевскую рандомизацию GWAS данных, показана генетическая связь между повышенным уровнем SHBG и низким риском возникновения РМЖ у женщин (в целом и ER-позитивного варианта заболевания).

SHBG в основном образуется в печени, и благодаря наличию стероид-связывающих сайтов он взаимодействует с половыми гормонами (тестостероном, эстрогенами и др.), связывает / транспортирует их, оказывая таким образом влияние на биодоступность и, соответственно, активность этих гормонов в организме [13]. Согласно нашим данным, rs8023580 NR2F2-AS1 является эпигенетически «активным» в печени (находится в энхансерных регионах, связан с уровнем метилирования генома и экспрессией гена RP11-327J17.2, находится в мотивах ДНК, взаимодействующих с шестью транскрипционными факторами), что может являться медико-биологической основой связи этого полиморфизма с уровнем продукции SHBG.

Согласно имеющимся литературным данным, SHBG имеет первостепенное значение в детерминации уровня «активного» (биодоступного) тестостерона в женском организме [8, 13], роль которого в развитии РМЖ доказана в масштабных эпидемиологических исследованиях [6, 14]. В исследовании S. Tin Tin и соавт., основанном на изучении сывороточного уровня тестостерона у 30 565 пременопаузальных (из них 527 имели РМЖ) и 133 294 постменопаузальных женщин (из них 2 997 имели РМЖ), показано рисковое значение как общего (HR = 1,18; 95% CI : 1,14–1,23), так и свободного (HR = 1,31; 95% CI : 1,23– 1,40) тестостерона для РМЖ у постменопаузальных женщин и отсутствие его связи с заболеванием у премено-паузальных женщин [6]. В масштабной работе S.N. Tang и соавт., выполненной с использованием менделевской рандомизации на материале многочисленной выборки женщин (n = 420 000) из UK Biobank ( n = 194 174) и Breast Cancer Association Consortium ( n = 228 951), продемонстрирована прямая генетическая связь между риском РМЖ и уровнем тестостерона (OR = 1,12) [14].

Механизмы, лежащие в основе связи тестостерона с РМЖ, являются малоизученными и во многом остаются неясными [6, 8]. В литературе приводятся следующие патофизиологические обоснования связи тестостерона с РМЖ, причем, как правило, более высокое содержание тестостерона имеет рисковое значение для РМЖ [6, 8, 15, 16]. Во-первых, тестостерон под действием ароматазы может преобразовываться в эстрадиол в жировой ткани и других органах, включая опухолевые клетки молочной железы, и таким образом реализовывать свои рисковые для РМЖ эффекты через эстроген-опосредованные патофизиологические механизмы [6].

Во-вторых, тестостерон участвует в контроле роста эпителия молочной железы за счет сбалансированного взаимодействия между двумя его активными метаболитами – эстрадиола (стимулирует пролиферацию клеток) и дигидротестостерона (ингибирует пролиферацию клеток). При этом повышенное содержание в организме тестостерона приводит к более высокой выработке эстрогенов и, соответственно, к гиперпролиферации клеток, которая не уравновешивается антипролиферативным действием дигидротестостерона [15]. Предполагается, что этот сдвиг в балансе андрогенов и эстрогенов лежит в генезе ER-положительных опухолей [15].

В-третьих, тестостерон может напрямую взаимодействовать с рецепторами андрогенов, которые присутствуют в опухолевых клетках молочной железы [16]. Рецепторы андрогенов находятся в цитоплазме и при отсутствии лигандов (андрогенов) связываются с белками теплового шока. Как только андрогены попадают в клетку, они соединяются со своими рецепторами, при этом данный комплекс (ан-дрогенырецепторы андрогенов) отсоединяется от белков теплового шока и переносит в ядро, где, взаимодействуя с различными ко-стимуляторами, ко-репрессорами, регуляторами транскрипции (miR-204, SOX-4, FOXA1 и др.), модулируют экспрессию ряда генов ( HER3, MYC, PTEN, GPER и др.), связанных с апоптозом, дифференцировкой, ангиогенезом, пролиферацией клеток, в том числе опухолевых (сигнальный путь Wnt/β-катенина, PI3K/AKT и др.) [16].

В-четвертых, молочная железа является модифицированной апокринной железой, которая (ее апокринные клетки) при стимулирующем действии андрогенов синтезирует эпидермальный фактор роста; взаимодействие данного фактора роста с соответствующими рецепторами (рецепторы эпидермального фактора роста и фактора роста эпителия человека 2) приводит к «активизации» клеточной пролиферации [15].

Литературные материалы указывают на существенное влияние SHBG на содержание «активного» (биодо-ступного) эстрадиола в женском организме [8, 13]. При этом роль эстрогенов в возникновении РМЖ (и в первую очередь при ER-позитивном РМЖ) подтверждена в многочисленных исследованиях [8, 17, 18]. В литературе указывается на несколько биологических механизмов, лежащих в основе рискового влияния эстрогенов на развитие РМЖ [8, 17, 18].

Во-первых, считается, что эстрогены повышают пролиферативную активность эпителиальных клеток молочной железы, и при этом в ходе более частых редупликаций ДНК этих клеток увеличивается вероятность возникновения мутаций, что может потенциировать последующее опухолевое перерождение клеток эпителия молочной железы [17, 18].

Во-вторых, повышенная пролиферация эпителиальных клеток молочной железы под действием эстрогенов сопровождается повышенной функциональной активностью митохондрий (обеспечивают дополнительный синтез энергии для чрезмерно пролиферирующих клеток), что потенциально может привести к увеличению содержания активных форм кислорода (оказывают повреждающее действие на ДНК) как побочного продукта процессов митохондриального окислительного фосфорилирования, способствуя тем самым образованию опухолевых клеток в молочной железе [17, 18].

В-третьих, метаболиты эстрогенов (полухиноны, хиноны) обладают мутагенными свойствами и могут за счет образования аддуктов и формирования активных форм кислорода приводить к повреждению ДНК [19]. Причем для метаболитов эстрогенов, взаимодействующих непосредственно с ДНК, не требуется наличие рецепторов эстрогенов для реализации своих патогенных эффектов, что может объяснить связь эстрогенов с развитием ER-негативного РМЖ [19].

В-четвертых, эстрогены могут обусловливать нарушения в клеточных реакциях на повреждение ДНК (нарушаются киназные механизмы оценки клеткой масштаба и тяжести повреждения ДНК, чтобы инициировать остановку клеточного цикла, репарацию или в случае непоправимого повреждения апоптоз) и механизмов репарации ДНК (нарушается эксцизионная репарация, нуклеотидная эксцизионная репарация, репарация несоответствия (mismatch) [17, 18].

Итак, эстрогены, обладая выраженными митогенными и мутагенными эффектами, стимулируют пролиферацию и канцерогенез в 60–70% случаев РМЖ [17]. Считается, что повышенный уровень эстрогенов в сыворотке крови приводит к увеличению риска развития РМЖ в 2–2,5 раза [20].