Получение эмбрионов in vitro методом межвидового оплодотворения яйцеклеток коров (Bos taurus) семенем зубра (Bison bonasus)

Европейский бизон, или зубр ( Bison bonasus ), — малочисленный вид, находящийся под угрозой исчезновения. Современная популяция европейского бизона сильно заинбридирована. Все современные зубры происходят от 12 особей, находившихся в начале XX века в зоопарках и заповедниках (1). Низкая генетическая изменчивость — одна из главных угроз для долгосрочного сохранения вида. Применение вспомогательных репродуктивных технологий, в частности получения эмбрионов in vitro с использованием яйцеклеток домашнего крупного рогатого скота и семени зубра, поможет не только сохранить имеющиеся генетические ресурсы вида, но и рационально использовать их в фундаментальных исследованиях по физиологии развития и для создания новых селекционных форм животных (2-4).

^∗ Работа поддержана Программой Президиума Российской академии наук, номер проекта IV.13.3.

Яйцеклетки коров — универсальный объект для межвидовой гибридизации. В литературе имеются данные об их оплодотворении in vitro семенем гаура (5), антилоп (6), лошадей (7), овец (8) и ослов (9). Предпосылкой экстракорпоральной гибридизации между ооцитами коров и спермой зубра служит близкое родство видов, отсутствие специфических антигенов на зоне пеллюцида (ЗП) яйцеклеток коров к сперматозоидам зубра (10), а также описанная ранее возможность получения от их скрещивания гибридного потомства (11).

Современное развитие технологий in vitro делает возможным эффективное и масштабное получение эмбрионов у домашних животных (1216). Однако при межвидовом экстракорпоральном оплодотворении (даже с участием близкородственных видов) биологическая полноценность ооцитов в процессе дальнейшего эмбрионального развития снижается (17). Один из вариантов решения проблемы — корректировка метода в зависимости от специфичности исходных половых клеток и эмбрионов.

При экстракорпоральной гибридизации с участием половых клеток редких и диких видов в качестве исходных протоколов для IVM (in vitro maturation, созревание in vitro)/IVF (in vitro fertilization, оплодотворение in vitro)/IVC (in vitro culture, культивирование in vitro), как правило, используют схемы, разработанные для домашних животных (17-19). Собственная технология получения эмбрионов in vitro для зубра пока не смоделирована. Случаи развития гибридов между Bos taurus и Bison bonasus в аналогичных условиях в литературе также не описаны.

В настоящей работе впервые показана возможность формирования и развития до стадии бластоцисты межвидовых гибридов, полученных после оплодотворения in vitro оцитов коров спермой зубра.

Целью исследования было оплодотворение яйцеклеток коров спермой зубра и оценка их дальнейшего эмбрионального развития in vitro с использованием протокола, рутинно применяемого для получения in vitro эмбрионов домашнего крупного рогатого скота.

Методика. Источником половых клеток самок служили яичники коров, отобранные после убоя и доставленные в лабораторию в течение 23 ч при 30-35 ° С.

Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли методом рассечения видимых фолликулов и промывали 3 раза в среде ТС-199, содержащей 5 % фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 10 мкг/мл гепарина, 0,2 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина («Sigma», США). Для экспериментов отбирали ооциты округлой формы с гомогенной цитоплазмой и равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные компактным кумулюсом. ОКК культивировали группами по 25-35 ооцитов в 500 мкл модифицированной среды ТС-199 (20) под слоем легкого минерального масла («Sigma», США) в течение 24 ч. Созревшие яйцеклетки переносили в среду оплодотворения Fert-TALP, содержащую 114 мМ NaCl, 3,2 мМ KCl, 0,4 мМ NaH 2 PO 4 ½2H 2 O, 2 мМ CaCl 2 ½2H 2 O, 0,5 мМ MgCl₂½6H₂O, 25 мМ NaHCO₃, 10 мМ HEPES, 10 мМ лактата натрия, 0,25 мМ пирувата натрия, 6 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), 10 мкг/мл гепарина, 20 мкМ пенициламина, 10 мкМ гипотаурина, 1 мкМ эпинефрина, 0,1 % заменимых аминокислот и 50 мкг/мл гентамицина («Sigma», США).

Для оплодотворения яйцеклеток использовали замороженное эпидидимальное семя, полученное после вынужденного отстрела зубра в возрасте 7 лет (оплодотворение $ корова — 8 зубр). Контролем служило семя быка (оплодотворение $ корова — 8 бык). Перед процедурой сперму раз- мораживали в течение 1 мин при 37 °C и обрабатывали методом «swim-up» (21) с использованием среды Sperm-TALP, содержащей 100 мМ NaCl, 3,1 мМ KC1, 0,3 мМ NaH2PO4•2H2O, 2 мМ CaCl2•2H2O, 1,5 мМ MgCl2•6H2O, 25 мМ NaHCO3, 10 мМ HEPES, 21,6 мМ лактата натрия, 1 мМ пирувата натрия, 6 мг/мл БСА («Sigma», США). Полученную фракцию активных сперматозоидов добавляли в чашки со средой Fert-TALP и созревшими ооцитами в дозе 1,0½106 сперматозоидов/мл.

Через 18-20 ч совместного культивирования ооциты освобождали от клеток кумулюса и налипших сперматозоидов, после чего часть из них использовали для цитологического анализа доли пенетрации и оплодотворения. Остальные переносили в специализированную среду (22) и культивировали до 7-х сут. Определяли долю раздробившихся яйцеклеток и выход бластоцист.

Для цитогенетического исследования ядерного материала осемененных ооцитов их фиксировали в 4 % параформальдегиде, подвергали процедуре пермеабилизации в 0,5 % растворе Triton Х-100, окрашивали DAPI в концентрации 1 мкг/мл («Sigma», США), после чего переносили на сухое обезжиренное стекло и заключали в среду Vectashield («Vector Laboratories», Великобритания). Цитологические препараты исследовали с использованием флуоресцентной световой микроскопии (микроскоп Axio-vert 40 CFL, «Carl Zeiss», Германия) при увеличении ½40.

При подсчете доли пенетрации учитывали наличие в цитоплазме созревших ооцитов конденсированных головок сперматозоидов и мужских пронуклеусов. Яйцеклетки с мужским и женским пронуклеусами или конденсированной головкой сперматозоида, а также находящиеся в анафазе II или телофазе II относили к клеткам с нормальным оплодотворением. Кроме того, ооциты, содержащие в цитоплазме более двух конденсированных головок сперматозоида и более двух мужских пронуклеусов, определяли как яйцеклетки с полиспермным оплодотворением.

Созревание и оплодотворение ОКК, а также культивирование эмбрионов осуществлялось при температуре 38,5 ° С в атмосфере с 5 % СО 2 и 90 % влажностью.

Эксперименты по культивированию ОКК были выполнены в 3-4 независимых повторах. Данные обрабатывали методом однофакторного дисперсионного анализа в программе SigmaStat («IMB SPSS», США). Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с использованием критерия Тьюки. Приведены значения в процентах ( X ) и ошибка средней ( m ).

Результаты. Домашний крупный рогатый скот ( Bos taurus ) — лидер по эффективности и масштабности получения эмбрионов in vitro. Существуют данные об экстракорпоральном оплодотворении яйцеклеток коров семенем различных видов животных (6-9), в том числе близкородственных: гаура ( Bos gaurus ), бантенга ( B. javanicus ) (5), яка ( B. grunniens ) (5, 18), африканского ( Syncerus caffer caffer ) и азиатского ( Bubalus bubalis ) буйволов (17, 19), а также американского бизона ( Bison bison ) (23).

Анализ данных, полученных в настоящей работе (табл. 1), показал возрастание доли ооцитов с признаками полиспермии при межвидовом оплодотворении (на 13,1 %, P < 0,05) по сравнению с внутривидовым, но не выявил различий между двумя видами оплодотворения ни в доле яйцеклеток с признаками проникновения сперматозоидов через зону пеллюци-да, ни в доле нормально оплодотворенных ооцитов. По данным литературы, при IVF у коров полиспермия наблюдается в 8-55 % случаев и зависит 826

от индивидуальных особенностей быка, концентрации спермы, а также условий капацитации и оплодотворения (24-25).

Как и в большинстве других работ, для получения межвидовых гибридных эмбрионов мы использовали технологическую систему, применяемую при экстракорпоральном оплодотворении у крупного рогатого скота (26). Поскольку в случае контакта яйцеклеток коров со сперматозоидами быка полиспермия была ниже, чем при их взаимодействии со сперматозоидами зубра, можно предположить, что при межвидовом оплодотворении была использована слишком высокая концентрация мужских половых клеток или условия взаимодействия женских и мужских клеток оказались неадекватными. Следует отметить, что сходные результаты наблюдались также при оплодотворении in vitro яйцеклеток коров семенем яка (18).

1. Результаты экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток коров ( Bos taurus ) заморожено-оттаянным эпидидимальным семенем быка и зубра ( Bison bonasus ) ( X ± m )

Оплодотворение	Число экспериментов	Осемененных ооцитов, n	Доля ооцитов, %
			с признаками пенетрации	c признаками нормального оплодотворения	с признаками полиспермного оплодотворения

/ корова ' бык          3             77           90,0±0,3          78,3±1,7            8,5±1,8^а

/корова—'зубр         3             81           93,3±1,7         73,2±2,3          21,6±0,8б а, б Различия достоверны при p < 0,05.

В более раннем исследовании гетерогенное оплодотворение яйцеклеток коров было использовано для оценки фертильности спермы европейского бизона. Результативность осеменения определяли по проникновению спермиев через ЗП ооцита и по формированию пронуклеусов (10). Вместе с тем лучшим свидетельством успешного взаимодействия половых клеток служит образование и развитие эмбрионов.

В наших экспериментах доля раздробившихся ооцитов и выход бластоцист после осеменения яйцеклеток коров спермой зубра были высокими и не отличались от таковых после оплодотворения спермой быка (табл. 2). Кроме того, в обоих случаях показатели эмбрионального развития соответствовали традиционным значениям, получаемым при IVF у крупного рогатого скота (13, 26).

2. Раннее эмбриональное развитие яйцеклеток коров ( Bos taurus ) после in vitro оплодотворения заморожено-оттаянным эпидидимальным семенем зубра ( Bison bonasus ) ( X ± m )

Оплодотворение	Число экспериментов	Осемененных ооцитов, n	Доля раздробившихся ооцитов, %	Доля ооцитов, резвившихся до стадии бластоцисты, %
				от осемененных от раздробившихся

/ корова— ' бык         4            143         72,4±2,5         26,7±1,9            37,1±2,6

/ корова— ' зубр         4            131         77,1±2,5         27,8±3,5            35,8±3,3

Результаты наших и проведенных другими авторами исследований (10) указывают на то, что мужские половые клетки самцов зубра способны распознавать специфическую углеводную последовательность гликопротеина прозрачной оболочки яйцеклеток коров и преодолевать межвидовой барьер, а ферменты акросом способствуют проникновению спермиев внутрь ксеногенных ооцитов. Кроме того, факт формирования двухклеточных гибридных эмбрионов и их развитие до стадии бластоцисты свидетельствует о сходстве механизмов активации ооцитов и их эмбрионального развития у коровы и самок зубра.

Таким образом, яйцеклетки коров могут быть оплодотворены спермой зубра, а полученные межвидовые зиготы способны формировать эмбрионы предымплантационной стадии развития. Также очевидно, что протокол IVM/IVF/IVC крупного рогатого скота в целом позволяет получать in vitro гибридные эмбрионы коровы и зубра, но высокая степень полиспермии, наблюдаемая при гетерогенном оплодотворении, указывает на необходимость его корректировки.