Получение межвидовых биопленок дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae и бактерий вида Streptococcus thermophilus методом ко-флокуляции

EDN:

В естественных условиях обитания микроорганизмы чаще встречаются в виде биопленок, чем в виде отдельных клеток. Биопленки могут покрывать абиотические поверхности, органы и ткани живых организмов. К факторам, позволяющим микроорганизмам образовывать биопленки, относятся в том числе и белки - лектины, входящие в состав клеточной стенки бактерий и грибов. В зависимости от вида микроорганизма лектиновый фактор межклеточного взаимодействия может иметь различные условия реактивности, в том числе требовать присутствия катионов кальция и/или остатков маннозы для эффективного межклеточного слипания [1]. Из литературных данных известны три группы генов лек-тиновой флокуляции: маннозо-зависимые Flo1 и NewFlo, а также нечувствительный к маннозе (MI) [2].

Известный механизм флокуляции саха-ромицетных дрожжей представляет собой белково-углеводную модель. Флокулирующие дрожжевые клетки обладают одновременно углеводными α-маннановыми остатками на поверхности клеточной стенки, и белковыми зимолектинами (лектины дрожжей) – рецепторами α-маннановых остатков, также входящих в состав наружного манно-протеинового слоя клеточной стенки грибков. В литературе высказано предположение, что взаимодействие зимолектинов с маннановыми компонентами приводит к флокуляции в присутствии ионов кальция, необходимых для правильной конформации зимолектинов [5].

Условно-патогенные стрептококки ротовой полости способствуют развитию кариеса, а также являются возбудителями молочнокислого брожения. Видовой состав в условиях нормобиоты чаще представлен Streptococcus salivarius (подвидом которого является лактококк S. thermophilus), S. mitis, S. oralis [3]. S. mutans и S. sanguis обнаруживаются в большом количестве в ротовой полости в случае повреждения эмали зубов. Представители вида S. salivarius известны способностью синтезировать внеклеточные полисахариды, в том числе маннаны, при утилизации моно- и дисахаридов. Отметим, что внеклеточный экзополисахарид стрептококка, не ассоциированный с клеточной стенкой в виде капсулы, на 1/4 состоит из остатков маннозы, что позволяет ему участвовать в формировании межвидовой биопленки путем взаимодействия с зимолектинами в присутствии катионов кальция. Экзопо-лисахариды способствуют прикреплению к зубной эмали других представителей микробиоты полости рта (явление ко-аггре-гации) и благоприятствуют увеличению стабильности общего полимерного матрикса биопленки [4].

Таким образом, возникает возможность включения возбудителей спиртового брожения в состав биопленки ротовой полости вместе с непатогенными представителями оральной микробиоты, продуцирующими экзо-полисахаридный матрикс, при их совместной флокуляции, что будет способствовать снижению кислотной нагрузки на зубную эмаль. Цель исследования – разработать метод ко-флокуляции дрожжей вида Saccharomy-ces cerevisiae и бактерий рода Streptococcus thermophilus var. lactis в общем экзополиса-харидном матриксе.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для проведения эксперимента был взят штамм осадочных винных дрожжей из Коллекции микроорганизмов виноделия лаборатории микробиологии Всероссийского национального научно-исследовательского института виноградарства и виноделия «Магарач» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» вида Saccharomyces cerevisiae , каталожный номер I-224, образующий осадок в виде крупных флокул. Негативным контролем служили нефлокулирующие пробиотические дрожжи Saccharomyces boulardii из препарата «Энтеростим Форте» (Индия). В качестве продуцента экзополисахаридного матрикса применяли бактериальный штамм S. thermophilus , выделенный из коммерческой молочной закваски Danisco CHOOZIT TA 45 (Франция). Для наращивания биомассы дрожжи культивировали при температуре 26 °С в течение пяти суток на стерильном виноградном сусле столовых сортов (массовая концентрация сахаров - 180,0 г/л, pH - 3,5); бактерии культивировали при температуре 26 °С в течение пяти суток на среде YPD (г/л: глюкоза – 20,0, пептон – 20,0, дрожжевой экстракт – 10,0; рН – 6,0–7,0).

Р и с. 1. Межвидовои ко-флокулят Saccharomyces cerevisiae I-224 и Streptococcus thermophilus

F i g. 1. Interspecies co-flocculate of Saccharomyces cerevisiae I-224 and Streptococcus thermophilus

Источник: здесь и далее рисунки получены авторами в программе MicroCamera

Source: herein and hereafter, the figures were obtained by the authors using the MicroCamera software

Р и с. 2. Отсутствие ко-флокуляции между Saccharomyces boulardii и Streptococcus thermophilus

F i g. 2. Absence of the co-flocculation between Saccharomyces boulardii and Streptococcus thermophilus

Ко-флокулят получали следующим способом: в стадию логарифмического роста биомассу микроорганизмов осаждали центрифугированием (4000 об/мин) в течение 2 мин, надосадочную жидкость сливали. Для разделения дрожжевых моновидовых флокул на отдельные клетки, активации клеточной стенки и экзополисахаридного матрикса перед дальнейшей межвидовой ко-флокуляцией полученные осадки монокультур ресуспензировали в стерильном растворе 0,3 моль/л оксалата калия. Встряхивание в пробирке производили до полного разрушения хлопьев, определяемого визуально. Ресуспензировали в стерильном растворе 0,9 % хлорида натрия. Полученный ресуспензат повторно центрифугировали, надосадочную жидкость удаляли. Осадок еще раз ресуспензировали в растворе 0,9 % хлорида натрия. По 1 мл полученной декальцифицированной взвеси дрожжей и бактерий помещали в общую пробирку, куда добавляли 2,0 мл 1,0 % стерильного раствора хлорида кальция. Полученную смесь активно встряхивали и оставляли на 30 мин для ко-флокуляции. Результаты учитывали микроскопически при увеличении × 900 с иммерсией после окраски 0,001 % раствором метиленового синего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рисунке 1 видно, что окрашенные цепочки стрептококков и клетки дрожжей включены в общий полисахаридный матрикс биопленки. Жизнеспособные дрожжи и матрикс не окрашиваются метиленовым синим. Матрикс становится видимым благодаря тому, что он обильно инкрустирован многочисленными кристаллами оксалата кальция. Предполагается, что дрожжи удерживаются в матриксе за счет высокой флокулирующей активности поверхностных лектинов S. сerevisiae I-224 с экзополисахари-дом S. thermophilus . Пространство, свободное от кристаллов оксалата кальция (в центре рисунка), не содержит стрептококков и дрожжевых клеток, что свидетельствует о прочности связывания всех компонентов биопленки.

Дрожжи с меньшей флокулирующей активностью, Saccharomyces boulardii, значительно хуже включаются в состав ко-флокулята (рис. 2). На изображении видно, что дрожжевые клетки взаимодействуют между собой, при этом практически не присоединяются к межвидовому ко-флокуляту со стрептококками.

Полученные результаты открывают возможность создания орального пробиотика на основе ко-флокуляции лактококка и дрожжей, а также введения в микробиом ротовой полости клеток других микробионтов, клеточная стенка которых обладает достаточным сродством к лектиновой кальций-зависимой флокуляции. Поскольку основным фактором образования зубного налета является осаждение гликопротеинов слюны, которые формируют защитную пелликулу, возникает базис для соединения полисахаридного матрикса искусственно полученного ко-флокулята с уже имеющейся биопленкой на эмали зуба [5].

ОБСУЖДЕНИЕ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Зимолектины наружного манно-протеинового слоя клеточной стенки дрожжей способны прочно связывать клетки грибков друг с другом через остатки маннозы в присутствии катионов кальция. Аналогичный эффект наблюдается при связывании дрожжей с внеклеточным экзополисахаридным маннозосодержащим матриксом, продуцируемым молочным стрептококком. Метод декальцификации клеточной стенки дрожжей и экзополи-сахарида стрептококков анионами оксалата с последующей ко-флокуляцией в присутствии катионов кальция позволяет создать прочный межвидовой конгломерат дрожжей и по-лисахарид-продуцирующих стрептококков, имитирующий биопленку. Разработанный метод предполагается применить для изготовления препарата комплексного орального пробиотика, позволяющего вытеснить возбудителей кариеса из биопленки зубного налета и снизить кислотную нагрузку на эмаль зубов путем частичной замены возбудителей молочнокислого брожения на возбудителей спиртового брожения.