Получение нового продуцента рекомбинантного афлатоксин-деградирующего фермента с помощью гетерологичной экспрессии в Pichia pastoris

Получение нового продуцента рекомбинантного афлатоксин-деградирующего фермента с помощью гетерологичной экспрессии в Pichia pastoris

Автор: Синельников И.Г., Зоров И.Н., Денисенко Ю.А., Микитюк О.Д., Синицын А.П., Щербакова Л.А.

Журнал: Сельскохозяйственная биология @agrobiology

Рубрика: Генетика, геномика, генетическая инженерия

Статья в выпуске: 6 т.57, 2022 года.

Бесплатный доступ

Загрязнение микотоксинами наносит значительный экономический ущерб пищевой и кормовой промышленности и серьезно угрожает здоровью человека и животных из-за мутагенности, онкогенности и других опасных свойств этих вторичных метаболитов грибов. Метод ферментативной деградации является эффективной и экологически приемлемой альтернативой химическим методам деконтаминации сельскохозяйственного сырья и пищевой продукции. В проведенном нами исследовании система экспрессии рекомбинантных белков, которую мы адаптировали для повышения копийности дрожжевых гетерологичных генов в хромосоме дрожжей Pichia pastoris, была впервые применена для получения фермента ADTZ-оксидазы из Armillaria tabescens , разлагающей афлатоксин В1. Cинтетический ген adtz указанного фермента был интегрирован в геном штамма P. pastoris GS115 под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы . Для амплификации гена adtz сконструировали олигонуклеотидные последовательности, к 5´-концу которых добавили специфические сайты рестрикции HindIII и NotI. После получения на основе вектора pPIG-1 плазмиды pPIG-ADTZ, содержащей ген adtz , ее линеаризовали посредством расщепления эндонуклеазой рестрикции ApaI и методом электропорации трансформировали клетки реципиентного штамма P. pastoris GS115. Полученные трансформанты дрожжевых клеток отбирали на среде Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YPD) с антибиотиком. Вставку целевого гена подтверждали с помощью ПЦР-амплификации, рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру. В результате получили 54 трансформанта штамма P. pastoris GS115, содержавшие вставку целевого гена adtz , и среди них отобрали наиболее активный продуцент - клон ADTZ-14 (выход общего внеклеточного белка 2,1 мг/мл). Секретируемый этим клоном рекомбинантный фермент ADTZ представлял собой мономерный белок с молекулярной массой 78±3 кДа, обладающий высокой аффинностью к афлатоксину В1 (АФВ1). Сохранение функциональных свойств полученного белка было подтверждено экспериментами по оценке его способности деградировать АФВ1 при кратковременной и длительной инкубации. Так, под воздействием ADTZ концентрация АФВ1, добавленного в бесклеточную культуральную жидкость (КЖ) клона ADTZ-14, снижалась на 14 % уже через 2 ч инкубации при 40 °С. После более длительной инкубации при 30 °С содержание добавленного АФВ1 (5 мг/мл) в бесклеточной КЖ было на 50 % ниже, чем в контроле (КЖ нетрансформированного штамма P. pastoris GS115), через 3 сут, а через 5 сут инкубации в тех же условиях деградация токсина достигала 80 %. Полученные данные свидетельствуют о достаточно высоком биотехнологическом потенциале нового продуцента рекомбинантного белка ADTZ и целесообразности дальнейших исследований по созданию на его основе ферментного препарата для деконтаминации растениеводческой продукции, загрязненной АФВ1.

Еще

Афлатоксин в1, микотоксины, энзиматическая деградация, adtz из armillaria tabescens, синтетический ген adtz, рекомбинантные белки, гетерологичная экспрессия, pichia pastoris

Короткий адрес: https://sciup.org/142237381

IDR: 142237381   |   DOI: 10.15389/agrobiology.2022.6.1166rus

Список литературы Получение нового продуцента рекомбинантного афлатоксин-деградирующего фермента с помощью гетерологичной экспрессии в Pichia pastoris

  • Джавахия В.Г., Стацюк Н.В., Щербакова Л.А., Поплетаева С.Б. Афлатоксины: ингибирование биосинтеза, профилактика загрязнения и деконтаминация агропродукции. М., 2017.
  • Coppock R.W., Christian R.G., Jacobsen B.J. Aflatoxins. In: Veterinary toxicology /R.C. Gupta (ed.). Academic Press, 2018: 983-994 (doi: 10.1016/B978-0-12-811410-0.00069-6).
  • Кононенко Г.П., Зотова Е.В., Буркин А.А. Опыт микотоксикологического обследования зернофуражных культур. Сельскохозяйственная биология, 2021, 56(5): 958-967 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.5.958rus).
  • Кононенко Г.П., Буркин А.А. Токсины микромицетов в генеративных органах растений семейства Fabacea. Сельскохозяйственная биология, 2021, 56(5): 968-978 (doi: 10.15389/agrobiology.2021.5.968rus).
  • Kumar P., Mahato D.K., Kamle M., Mohanta T.K., Kang S.G. Aflatoxins: A global concern for food safety, human health and their management. Front. Microbiol., 2017, 7: 2170 (doi: 10.3389/fmicb.2016.02170).
  • Romani L. Immunity to fungal infections. Nat. Rev. Immunol., 2004, 4(11): 1-23 (doi: 10.1038/nri1255).
  • El-Sayed R.A., Jebur A.B., Kang W., El-Demerdash F.M. An overview on the major mycotoxins in food products: characteristics, toxicity, and analysis. Journal of Future Foods, 2022, 2(2): 91-102 (doi: 10.1016/j.jfutfo.2022.03.002).
  • Schuda P.F. Aflatoxin chemistry and syntheses. In: Syntheses of natural products. Topics in current chemistry, V. 91. Springer, Berlin, Heidelberg, 1980: 79-81 (doi: 10.1007/3-540-09827-5_3).
  • Mahato D.K., Lee K.E., Kamle M., Devi S., Dewangan K.N., Kumar P., Kang S.G. Aflatoxins in food and feed: an overview on prevalence, detection and control strategies. Front. Microbiol., 2019, 10: 2266 (doi: 10.3389/fmicb.2019.02266).
  • Probst C., Njapau H., Cotty P.J. Outbreak of an acute aflatoxicosis in Kenya in 2004: identification of the causal agent. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73(8): 2762-2764 (doi: 10.1128/aem.02370-06).
  • Medina A., Gilbert M.K., Mack B.M., O’Brian G.R., Rodriguez A., Bhatnagar D., Payne G., MaganN. Interactions between water activity and temperature on the Aspergillus flavus transcriptome and aflatoxin B1 production. Int. J. Food Microbiol., 2017, 256: 36-44 (doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2017.05.020).
  • Shcherbakova L.A., Statsyuk N.V., Mikityuk O.D., Nazarova N.A., Dzhavakhiya V.G. Aflatoxin B1 degradation by metabolites of Phoma glomerata PG41 isolated from natural substrate colonized by aflatoxigenic Aspergillus flavus. Jundishapur J. Microbiol., 2015, 8(1): e24324 (doi: 10.5812/jjm.24324).
  • Ji C., Fan Y., Zhao L. Review on biological degradation of mycotoxins. Anim. Nutr., 2016, 2(3): 127-133 (doi: 10.1016/j.aninu.2016.07.003).
  • Verheecke C., Liboz T., Mathieu F. Microbial degradation of aflatoxin B1: current status and future advances. Int. J. Food Microbiol., 2016, 237: 1-9 (doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2016.07.028).
  • Alberts J.F, Gelderblom W.C.A., Botha A., van Zyl W.H. Degradation of aflatoxin B1 by fungal laccase enzymes. Int. J. Food Microbiol., 2009, 135: 47-52 (doi:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.07.022).
  • Taylor M.C., Jackson C.J., Tattersall D.B., French N., Peat T.S., Newman J., Briggs L.J., Lapal-ikar G.V., Campbell P.M., Scott C., Russell R.J., Oakeshott J.G. Identification and characteri-zation of two families of F420H2-dependent reductases from Mycobacteria that catalyse aflatoxin degradation. Mol. Microbiol., 2010, 78(3): 561-575 (doi: 10.1111/j.1365-2958.2010.07356.x).
  • Zhao L.H., Guan S., Gao X., Ma Q.G., Lei Y.P., Bai X.M., Ji C. Preparation, purification and characteristics of an aflatoxin degradation enzyme from Myxococcus fulvus ANSM068. J. Appl. Microbiol., 2011, 110(1): 147-155 (doi: 10.1111/j.1365-2672.2010.04867.x).
  • Wang Y., Zhao C., Zhang D., Zhao M., Zheng D., Lyu Y., Cheng W., Guo P., Cui Z. Effective degradation of aflatoxin B1 using a novel thermophilic microbial consortium TADC7. Bioresource Technology, 2017, 224: 166-173 (doi: 10.1016/j.biortech.2016.11.033).
  • Guo Y.P., Qin X.J., Tang Y., Ma Q.G., Zhang J.Y., Zhao L.H. CotA laccase, a novel aflatoxin oxidase from Bacillus licheniformis, transforms aflatoxin B-1 to aflatoxin Q(1) and epi-aflatoxin Q(1). Food Chem., 2020, 325: 126877 (doi: 10.1016/j.foodchem.2020.126877).
  • Adebo O.A., Njobeh P.B., Gbashi S., Nwinyi O.C., Mavumengwana V. Review on microbial degradation of aflatoxins. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2017, 57(15): 3208-3217 (doi: 10.1080/10408398.2015.1106440).
  • Xu H.W., Wang L.Z., Sun J.D., Wang L.P., Guo H.Y., Ye Y.L., Sun X.L. Microbial detoxifica-tion of mycotoxins in food and feed.Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2022, 62(18): 4951-4969 (doi: 10.1080/10408398.2021.1879730).
  • Li C.H., Li W.Y., Hsu I.N., Liao Y.Y., Yang C.Y., Taylor M.C., Liu Y.F., Huang W.H., Chang H.H., Huang H.L., Lo S.C., Lin T.Y., Sun W.C., Chuang Y.Y., Yang Y.C., Fu R.H., Tsai R.T. Recombinant aflatoxin-degrading F420H2-dependent reductase from Mycobacterium smegmatis protects mammalian cells from aflatoxin toxicity. Toxins, 2019, 11(5): 259 (doi: 10.3390/toxins11050259).
  • Kolosova A., Stroka J. Substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins: a review. World Mycotoxin Journal, 2011, 4(3): 225-256 (doi: 10.3920/WMJ2011.1288).
  • Loi M., Fanelli F., Zucca P., Liuzzi V.C., Quintieri L., Cimmarusti M.T., Monaci L., Haidu-kowski M., Logrieco A.F., Sanjust E., Mulè G. Aflatoxin B1 and M1 degradation by Lac2 from Pleurotus pulmonarius and redox mediators. Toxins, 2016, 8(9): 245 (doi: 10.3390/toxins8090245).
  • Brana M.T., Sergio L., Haidukowski M., Logrieco A.F., Altomare C. Degradation of aflatoxin B-1 by a sustainable enzymatic extract from spent mushroom substrate of Pleurotus eryngii. Toxins, 2020, 12(1): 49 (doi: 10.3390/toxins12010049).
  • Wang J., Ogata M., Hirai H., Kawagishi H. Detoxification of aflatoxin B1 by manganese peroxi-dase from the white-rot fungus Phanerochaete sordid YK-624. FEMS Microbiol. Lett., 2011, 314(2): 164-169 (doi: 10.1111/j.1574-6968.2010.02158.x).
  • Yao D.S., Liang R., Liu, D.L., Gu L.Q., Ma L., Chen W.Q. Screening of the fungus whose multienzyme system has catalytic detoxification activity towards aflatoxin B1 (Part I). Ann. N.Y. Acad. Sci., 1998, 864: 579-585 (doi: 10.1111/j.1749-6632.1998.tb10385.x).
  • Liu D.-L., Yao D.-S., Liang Y.Q., Zhou T.-H., Song Y.-P., Zhao L., Ma L. Production, purifi-cation, and characterization of an intracellular aflatoxin-detoxifizyme from Armillariella tabescens (E-20). Food Chem. Toxicol., 2001, 39(5): 461-466 (doi: 10.1016/s0278-6915(00)00161-7).
  • Cao H., Liu D., Mo X., Xie C., Yao D. A fungal enzyme with the ability of aflatoxin B1 conver-sion: purification and ESI-MS/MS identification. Microbiol. Res., 2011, 166(6): 475-483 (doi: 10.1016/j.micres. 2010.09.002).
  • Wu Y.Z., Lu F.P., Jiang H.L., Tan C.P., Yao D.S., Xie C.F., Liu D.L. The furofuran-ring selectivity, hydrogen peroxide-production and low Km value are the three elements for highly effective detoxification of aflatoxin oxidase. Food Chem. Toxicol., 2015, 76: 125-131 (doi: 10.1016/j.fct.2014.12.004).
  • Xingming Y. Oral liquid medicine from ferments of Armilarilla tabescens. China PAT # CN1679642. Priority date 11. 05.2004. Publication date 01.08.2007.
  • Chahardooli M., Niazi A., Aram F., Sohrabi S.M. Expression of recombinant Arabian camel lactoferricin-related peptide in Pichia pastoris and its antimicrobial identification. J. Sci. Food Agric., 2016, 96(2): 569-575 (doi: 10.1002/jsfa.7125).
  • Wang Y., Wang Y., Jiang J., Zhao Y., Xing F., Zhou L. High expression of zearalenone de-grading enzyme in Pichia pastoris. Chinese Journal of Biotechnology, 2020, 36(2): 372-380 (doi: 10.13345/j.cjb.190150).
  • Синельников И.Г., Зоров И.Н., Синицына О.А., Синицын А.П., Рожкова А.М. Интегра-ционный вектор для многокопийной интеграции генов в 18Sр РНК дрожжей Pichia pastoris. № RU 2752904C1, Моск. ФГУ Исследовательский Центр «Основы Биотехнологии» РАН (РФ). Заявл. 02.09.20. Опубл. 11.08.21. Бюл. № 23.
  • Lin-Cereghino J., Wong W.W., Xiong S., Giang W., Luong L.T., Vu J., Johnson S.D., Lin-Cereghino G.P. Condensed protocol for competent cell preparation and transformation of the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Biotechniques, 2005, 38(1): 44-48 (doi: 10.2144/05381BM04).
  • Lõoke M., Kristjuhan K., Kristjuhan A. Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications. Biotechniques, 2011, 50(5): 325-328 (doi: 10.2144/000113672).
  • Waterborg J.H., Matthews H.R. The Lowry method for protein quantitation. In: Proteins. Methods in molecular biology™, vol 1 /J.M. Walker (ed.). Humana Press, 1984: 1-3 (doi: 10.1385/0-89603-062-8:1).
  • Dzhavakhiya V.G., Voinova T.M., Popletaeva S.B., Statsyuk N.V., Limantseva L.A., Shcherbakova L.A. Effect of various compounds blocking the colony pigmentation on the aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus. Toxins, 2016, 8(11): 313 (doi: 10.3390/toxins8110313).
  • Yang P., Xiao W., Lu S., Jiang S., Zheng Z., Zhang D., Zhang M., Jiang S., Jiang S. Recombinant expression of Trametes versicolor aflatoxin B1-degrading enzyme (TV-AFB1D) in engineering Pichia pastoris GS115 and application in AFB1 degradation in AFB1-contaminated peanuts. Toxins, 2021, 13(5): 349 (doi: 10.3390/toxins13050349).
  • Wang J.R., Li Y.Y., Liu D.N., Liu J.S., Li P., Chen L.Z., Xu S.D. Codon optimization significantly improves the expression level of -amylase gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris. BioMed Research International, 2015, 2015: 248680 (doi: 10.1155/2015/248680).
  • Liu K., Ouyang Y., Lin R., Ge C., Zhou M. Strong negative correlation between codon usage bias and protein structural disorder impedes protein expression after codon optimization. J. Biotechnol., 2022, 343: 15-24 (doi: org/10.1016/j.jbiotec.2021.11.001).
Еще
Статья научная
QR-код для установки приложения SciUp Наведите камеру и скачайте бесплатное приложение SciUp